人乳头状瘤病毒引起宫颈肿瘤的病理过程及其机制

　【摘要】 人乳头状瘤病毒(HPV)是双链闭环小分子DNA病毒，基因组全长约8kb，组成6个早期表达基因(E6、E7、E1、E2、E4、E5)和2个晚期表达基因(L1、L2)。高危型HPV的E6和E7基因是病毒癌基因。E6和E7蛋白分别结合和降解P53和PRb蛋白，导致细胞周期失控、染色体不稳定、基因扩增、丢失和突变等改变，从而促使宫颈肿瘤的发生和发展。HPV导致宫颈肿瘤的病理机制包括持续性感染、E6和E7基因表达和蛋白功能的改变、HPV整合至宿主细胞DNA等，其中以E6和E7基因表达和蛋白功能的改变为中心。E6和E7蛋白的功能状态决定宫颈上皮内肿瘤的进退和浸润癌的恶性形状的维持和演进，但具体机制还不清楚。进一步研究与E6和E7蛋白相互作用的分子及其机理将可揭示宫颈肿瘤发生发展的病理规律，为最终控制宫颈癌打下基础。  

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　　【关键词】 人乳头状瘤病毒;宫颈上皮内肿瘤;宫颈浸润癌;病理发病学

　　基金项目：2004年国家人事部留学人员择优科技项目;2004年湛江市科技招标项目

　　人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus, 简称HPV)是通过密切接触而传播的DNA病毒。在人体组织中，HPV主要感染皮肤和黏膜组织。1981年，Zur在宫颈肿瘤组织中检测到HPV[1]。后来人们发现HPV存在于几乎100%的宫颈癌组织中[2]，近来又发现HPV存在于阴道、外阴、肛周、手、足、头颈、口腔、咽喉、食管、肺等处的肿瘤组织中[35]。迄今为止，HPV被认为是感染组织部位最广泛的人类肿瘤病毒之一，显示出其致瘤的重要性。近20多年来积累了大量的关于HPV和宫颈肿瘤的研究文献，表明HPV是引起宫颈肿瘤的必须条件，但不是充分条件[6]。本文就HPV在宫颈肿瘤的发生发展中的病理作用和作用机制方面介绍近年来的某些研究进展。

　　1 HPV的基因组结构和各基因的主要功能

　　HPV是双链环形封闭的小分子DNA病毒，其基因组全长约8kb，除一段调控序列(long control region, LCR)外，其余组成8个基因，包括6个早期表达基因 (E6、 E7、 E1、 E2、 E4、 E5) 和2个晚期表达基因 (L2、L1)[2]。L1基因的DNA序列相当保守，被用作HPV鉴定和分型的依据。凡被分离的HPV，如其L1基因DNA序列与已确定类型HPV的L1基因DNA序列有10%以上的差异时即为新的HPV类型[7]。至今已有近百种HPV类型被分离确定，其中约40余种可感染生殖道黏膜上皮组织[6]。根据其致瘤性质，这些感染生殖道的HPV又可分为高危型和低危型。高危型HPV是指可以引起恶性肿瘤的HPV，如引起宫颈癌的HPV16、HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV58等，而低危型HPV是指仅引起良性肿瘤的HPV，如引起宫颈湿疣(condyloma cuminatum)的HPV6、HPV11等[6]。下面介绍高危型HPV各基因的主要功能。

　　1.1 E6和E7基因

　　E6和E7基因已被广泛深入的研究。这两个基因在宫颈癌中持续存在并高表达，提示其在宫颈癌的形成和恶性性状的维持中起重要作用。在细胞转化实验中，E6和E7蛋白各自或联合可以使人纤维母细胞、乳腺上皮细胞或其他角化上皮细胞永生化[89]。E6和E7蛋白的致瘤性在E6和E7蛋白水平降低时可被逆转，如用地塞米松减低HPV感染细胞的E6和E7基因表达水平时，细胞不能转化为恶性瘤细胞[10]。而且给宫颈癌细胞转染E6和E7基因的反义DNA质粒、特异核酸酶或反义寡核甘酸在抑制E6和E7基因表达的同时也明显抑制癌细胞的生长。这些体外实验提示E6和E7基因具有病毒癌基因的功能，这在一系列生化实验中得到进一步的证实。

　　E6蛋白约含150个氨基酸，有两个锌指结合的结构域cysxxcys。已发现E6可结合多种蛋白，其中最重要的应是结合P53蛋白，并通过与之结合的E6AP蛋白而活化泛素蛋白酶体途径降解P53蛋白[11]，是著名的肿瘤抑制基因(p53)的蛋白。P53的主要功能是控制细胞周期G1/S和G2/M两个关卡。在细胞DNA损伤情况下，P53激活p21，抑制细胞从G1期进入S期，使损伤的DNA在复制之前有足够的时间修复。如果DNA损伤过重，P53激活Bak(Bcl2家族成员之一)，bax1和fas受体基因等，诱导细胞凋亡。E6蛋白结合并降解P53蛋白，使DNA受损的细胞既不能修复DNA损伤，又不发生凋亡，后果是细胞带着损伤的DNA进行分裂繁殖，将DNA损伤传给子代细胞。多次DNA损伤在细胞内累积，使细胞遗传逐渐不稳定，发生越来越严重的异常重组，最终形成肿瘤。E6蛋白使细胞永生化的另一个途径是增加端粒酶hTERT的活性[12]。端粒酶催化把六碱基重复序列加到端粒上，稳定染色体，维持细胞的分裂增殖能力。体细胞的端粒酶活性较低，每经历一次核分裂而变短的端粒得不到补偿，最后染色体不稳定，细胞丧失分裂能力。E6蛋白通过myc和Sp1提高hTERT的转录水平[13],增强hTERT的功能，使细胞永生化。E6还可通过阻断E6Ap介导的Blk (src家族酪氨酸激活) 蛋白的降解，使细胞持续分裂。此外，E6还有增强外源DNA整合和细胞基因突变性，使中心粒异常和染色体不稳定，阻断干扰素的产生、结合并降低P16蛋白水平等功能及其他的生化特性[6]。可见E6是个多功能病毒癌基因蛋白，其中结合并降解P53蛋白是使细胞完全转化所必需的条件，激活hTERT是使细胞永生化的条件。

　　E7蛋白约100个氨基酸，有三个保守区(conserved region, CR)。CR1位于N端，CR2含有LXCXE结构域，CR3含两个锌指样结构域。E7的中心功能就是通过三个保守区域之一与Rb蛋白家族(PRb、P107、P130)结合并通过泛素26S蛋白酶体途径降解PRb家族蛋白[14]。Rb蛋白家族处于细胞周期G1/S关卡的中心环节。在去磷酸化状态下Rb蛋白结合转录因子E2f蛋白，阻止E2f蛋白激活众多的与DNA复制有关的蛋白因子，从而抑制DNA合成和细胞周期进展，使细胞处于G0/G1期和进行细胞分化。E7蛋白结合并降解Rb蛋白，释放E2f蛋白使激活许多相关的DNA合成的蛋白因子，加快DNA复制和细胞的分裂繁殖，促进细胞的转化。E7蛋白结合细胞周期素A和E，并提高A和E的蛋白水平，及结合细胞周期素依赖蛋白激酶抑制物P21和P27并阻断P21和P27的功能[15]。细胞周期素E活性升高和P21及P27功能下降都能增强细胞周期素依赖蛋白激酶的活性，从而使Rb蛋白过磷酸化而释放E2f蛋白，促进细胞周期的进展。E7蛋白还能结合HDACs(组胺脱酰酶)。HDACs使组蛋白脱酰基，促进组蛋白与DNA双链形成核小体，阻止DNA的复制和转录。HDACs还使E2f蛋白脱酰基而灭活。E7蛋白结合并降解HDACs，使组蛋白从核小体中脱出，核小体解体，DNA解链，激发DNA的复制。同时HDACs降低也使E2f活性增加，有利于DNA的合成。此外，E7蛋白还能结合如P48等10多种其他蛋白，可以提高外源性DNA整合和细胞基因突变性，诱导细胞凋亡，抑制cdk抑制蛋白，降解酪氨酸激酶Blk,维持HPV的游离环状结构，使染色体中心粒数目异常并形成非整倍体，激活E2f 调节的分裂基因等[6,15]。

　　尽管有不少研究指出E6和E7的表达是维持细胞永生化或恶性性状所必需，但也有许多实验表明E6和E7蛋白各自或联合均不足使正常细胞永生化或恶变。在与其他癌基因如Hras共转染时，E6和E7才能转化细胞[16]。在细胞杂交实验中，由E6和E7永生化或转化的细胞互相融合后出现休止状态的克隆或去瘤化克隆[17]。这种结果表明有多种不同的基因或功能途径在细胞永生化或转化时起作用。在细胞融合时由于不同的基因或功能途径互补替代，使永生化或转化细胞克服基因功能缺陷，绕过E6和E7蛋白而逆转。目前，HPV阳性细胞之间的“互补替代而逆转”的机制还不清楚，需要进一步研究E6和E7蛋白与其他蛋白的结合和相互作用来阐明这个令人感兴趣的问题。

　　1.2 其他基因

　　E1蛋白约68kDa,在HPV阳性细胞中低水平表达，其主要的生化特性是具有ATP酶和3’→ 5’解旋酶活性，能够识别HPV的复制起点[18]。E1蛋白识别并结合到富含AT的HPV复制起点序列，在E2蛋白和其他解旋酶的配合下，解除HPV 的DNA超螺旋，让复制复合物进入并启动DNA复制[1920]。

　　E2蛋白约50 kDa，N端含有转录激活结构域，C端含有DNA结合区。完整的E2蛋白具有病毒DNA复制和调节转录的双重功能[21]。E2蛋白识别和结合在E1蛋白结合位点邻近的DNA复制起点序列上，促进E1蛋白到位和提高E1蛋白对复制起点的亲和力，从而参与启动病毒DNA的复制[21]。在低蛋白水平时，E2蛋白激活包括其自身的早期基因的转录，但在高水平时通过与TFⅡD和SP1等转录因子的结合而抑制早期基因尤其是E6和E7基因的转录，从而控制在未分化细胞中的病毒拷贝数。在分化细胞中，E2转移至不受E2蛋白抑制的晚期启动子，提高E1和E2的表达，增加病毒的拷贝产量[2223]。另一种情况是，E2有两种表达形式，全蛋白和仅有DNA结合区的蛋白。前者具有转录激活的功能，增加病毒的复制，后者具有转录抑制功能[24]。

　　在HPV阳性的细胞里，E4是HPV基因组中表达水平最高的一个基因[25]，但其确切功能和意义还未清楚，可能具有与E7基因相反的作用。E5被认为是一个弱性病毒癌基因，是除E6和E7外的第三个病毒癌基因。E5蛋白能够结合EGF受体，使之磷酸化，抑制其降解[26]。但在宫颈癌细胞中E5经常丢失。E5主要在分化上皮细胞中表达，说明其主要在分化的上皮细胞中起作用[27]。

　　L1和L2是晚期表达基因。在病毒DNA复制完毕后，L1表达的大壳蛋白和L2表达的小壳蛋白共同构成病毒的外壳，包装病毒DNA成一个完整的病毒颗粒，从上皮表层细胞释放出来[28]。

　　1.3 E6和E7基因表达的调控

　　在细胞内的HPV呈两种生活形态，即游离型和整合型。游离型是独立完整的封闭环状双链DNA，是病毒复制的模板。此型HPV使用两个主要启动子：早期启动子开始于E6 ORF上游1kb，调控早期基因的转录;晚期启动子位于E7 ORF内，调节晚期基因表达。此外HPV还能用mRNA拼接机制和Leaky Scnning翻译机制在mRNA处理和翻译水平进行调节[15]。在未分化细胞内，E6和E7的表达被低水平表达的E2所激活;在分化细胞内，被高水平表达的E2抑制。整合状态的HPV通常在E1和E2基因内断裂变为线性DNA双链，伴有部分DNA序列丢失。此时HPV基因的表达完全在整合位点的细胞基因组的调控之下，HPV病毒也不能自主复制。

　　2 HPV整合

　　HPV DNA整合到细胞基因组是一件不可逆转的事件[29]。采用Southern blot、连接介导PCR (ligationmediatedPCR)、病毒癌基因转录体扩增(amplification of papillomavirus oncogene transcripts assay)等方法分离出约192个HPV整合位点[29]。这些整合位点几乎平均分布于所有的染色体中，整合位点之间的细胞DNA序列不相同，整合部位与整合的HPV基因DNA序列也不相同，表明HPV整合是一种随机性非同源性重组活动。虽然整合是随机的，但似有一定的倾向性，有38%的整合位点落在染色体的脆性部位，如3p14.2的FAR3B、8q24的myc位点、19p13.2的JunB位点等[29]。所谓染色体脆性部位是DNA易断裂处，易被外源性DNA插入，多位于没有基因的部位或基因的内显子。在细胞株ME180细胞中，HPV16整合到APM1基因内，而另一等位基因丢失。APM1基因具有弱的肿瘤抑制功能[30]。个别时候，HPV整合于靠近myc基因的位置。但至今还未见关键的肿瘤相关基因被HPV整合破坏或导致明显表达改变的研究报道。整合的E6和E7基因通常与相邻细胞DNA一起转录，其转录体较为稳定，从而提高E6和E7的表达，使带有HPV整合的细胞比带有游离型HPV的细胞更易出现染色体不稳定，包括中心粒异常、间期桥联、染色体断裂和非整倍体[31]。用HPV整合的E6和E7 cDNA转染细胞比用游离型HPV的E6和E7 cDNA更易使细胞永生化[31]。在临床病例中，低级宫颈上皮内肿瘤(cervical intraepithelial neoplasms, CIN)细胞一般只含游离型HPV，而高级CIN和浸润癌出现HPV的整合[3233]。这些现象都表明HPV整合影响宫颈肿瘤的发生发展主要是通过增强HPV E6和E7基因的功能，而较少通过改变细胞基因的结构和功能。

　　3 HPV引起宫颈肿瘤的病理过程及机制

　　宫颈癌是以鳞状上皮细胞癌为主，约占90%，其余为腺癌、小细胞癌等。普遍认为宫颈鳞状细胞癌是由CIN发展而来，而CIN又是起源于鳞状上皮基底细胞[3435]。CIN分为低级CIN (CINⅠ级) 和高级CIN (CINⅡ/Ⅲ级)，两者的生物学行为不一样。在低级CIN中，约60%自行消退，30%长期静止维持，10%进展到高级CIN，1%进展到浸润癌。在高级CIN中，约30%～40%可自行消退，40%～50%长期维持，12%可进展到浸润癌[7]。换一句话说，宫颈肿瘤发生发展的病理过程是：HPV 感染宫颈基底细胞→低级CIN→高级CIN →浸润癌。

　　近20年来的流行病学、临床病理学和实验室研究结果表明HPV在宫颈肿瘤的发生发展过程中起重要作用，其主要根据有：HPV感染先于宫颈肿瘤的发生，随着宫颈肿瘤病变程度的进展，HPV的检出率逐渐升高，在宫颈浸润癌中的检出率为100%;高危型HPV的E6和E7基因能使正常细胞永生化和转化;高危型E6和E7蛋白可分别结合和灭活p53和pRb;HPV可整合到宿主细胞基因组中，引起基因突变等[34]。

　　在正常宫颈上皮中，HPV通过硫酸肝素(heparin sulfate)与上皮细胞粘附，然后与未知的受体结合进入细胞[36]。HPV可感染上皮表层细胞或由于微小损伤而暴露的基底细胞。如果感染表层分化的上皮细胞，HPV将会随着上皮细胞的成熟老化而脱落清除，成为短暂感染。只有感染基底细胞才有可能形成持续感染。在未分化细胞中，HPV的E2基因开始低水平表达，激活早期表达启动子，增加E1、E2、E6、E7基因的表达。E1和E2蛋白是HPV基因组复制的启动因子[20]。E6和E7蛋白可分别结合和灭活P53和PRb蛋白[11,14]，迫使宿主细胞由G1期进入S期，DNA开始复制并为HPV基因组复制提供一套完全的DNA合成系统。HPV借助宿主细胞的DNA合成体系复制，使其在一个未分化细胞中达到20～100个拷贝。当HPV拷贝数升高时，E2表达水平也随之升高。高水平的E2蛋白可抑制早期启动子，降低E1、E2、E6、E7基因的表达，HPV复制受抑制，从而保持HPV拷贝数在未分化细胞中的稳定[15]。当感染的未分化细胞分裂时，将所含的HPV DNA分配到两个子代细胞。其中一个子细胞仍然作为未分化细胞保持在基底层的未分化细胞库里，另一个进入分化程序[28]。分化细胞的分化机制激活了HPV晚期启动子，增加E1和E2表达并启动L1和L2的表达[15]。E1和E2蛋白的增加进一步加强HPV复制，提高HPV在分化细胞中的拷贝数[1921]，而L1和L2蛋白组成蛋白壳粒，包装HPV DNA形成成熟的HPV颗粒[28]。HPV颗粒可从表层角化细胞中释出或随角化细胞的脱落崩解而释出，成为新的感染源。值得注意的是，上皮细胞分化机制激活的晚期启动子一般不导致E6和E7表达水平的增加，所以如果无其他意外因素的参与，宿主细胞不改变其分化程序。在HPV的生活周期中，起码有两个重要的机制未清楚，一是HPV如何侵入宿主细胞，另一是宿主细胞的分化程序如何激活HPV的晚期启动子。

　　大多数HPV感染属于短暂感染，只有部分HPV感染成功地建立持续性感染[34]。持续性感染的机制还不清楚，推测其与感染的细胞状态、细胞的内外环境和患者的免疫状态有关。如果HPV感染的是分化细胞，一方面在不改变宿主细胞分化程序时HPV将会随宿主细胞的成熟脱落而被清除，另一方面由于产生的病毒颗粒从细胞膜表面释出，容易激活机体的免疫反应而被清除，因而不能建立持续性感染。如果HPV感染的是基底层未分化细胞，由于未分化细胞的不对称分裂(一个子代细胞作为未分化细胞，另一个进入分化程序)而有机会建立持续性感染。未分化细胞的持续性感染是HPV导致宫颈肿瘤发生的前提[7]。基底细胞分裂后，其中一个移出基底层，进入棘层。由于持续性感染维持时间较长，在某种偶然因素作用下，HPVE6和E7在进入棘层的细胞中的表达较平时略高，暂时阻断了宿主细胞的分化，使细胞出现非整倍体、染色质增多等非典型增生的形态改变。经过一定的分化时段后，非典型增生细胞内的E6和E7表达水平恢复，或细胞内的分化机制逐渐占优，宿主细胞重新进入分化，并向上皮表层逐渐推移。上述过程形成了低级CIN。在病理学上可观察到靠近基底层的细胞具有异型性，占据表皮全层的1/3以下，其余2/3层细胞形态正常[35]，在未知的原因和机制作用下，部分病例的基底层未分化细胞的E6和E7表达水平回复，或HPV被清除，不再产生非典型细胞，此时，低级CIN消退;在另一部分病例中，原略高表达的E6和E7水平维持不变，则继续产生非典型增生细胞，此时，低级CIN维持。在HPV整合事件发生后或其他未知因素的作用下，部分病例的低级CIN细胞中的E6和E7蛋白水平进一步增加，引起并积累更多的遗传物质改变如基因扩增、丢失、点突变、染色体异常等，使细胞分裂增殖更快，非典型增生更明显，形成高级CIN。高级CIN形成后仍有较多机会消退或维持，但具体机制不清楚：推测是与E6和E7表达水平或功能的改变有关[7,3435]。部分高级CIN由于E6和E7蛋白水平较高，除明显影响p53和pRb功能外，还影响粘附分子如细胞和基底膜之间的整合素和细胞与细胞之间的Cadherin的分布和产量，前者导致CIN细胞分裂更快，后者使CIN细胞侵袭突破基底膜，从而形成浸润癌[3738]。浸润癌形成后E6和E7继续高表达，以维持癌细胞的恶性性状和不断的恶性演进。

　　然而，与感染HPV的人数相比，发生CIN的病例占少数，最后形成浸润癌的更少。可以想象，除HPV感染外，还有其他因素参与宫颈肿瘤的病理过程，但都可能与HPV感染及病毒癌基因E6和E7的活动有关[6]。HPV类型是最确定的因素之一。高危型HPV如HPV16和HPV18比其他类型更常见于宫颈肿瘤中[3435]。有研究报道HPV变异也影响HPV的致瘤能力[3940]，但未得到广泛的认同[4142]。HLA类型和P53多态性可能影响对HPV感染的敏感性[4344]，但同样未得到广泛支持。宿主内的免疫力对HPV感染的清除无疑是重要的，但具体机制还不清楚[6]。宿主体内某些细胞因子如干扰素、TNF、IL6、IL17等水平对HPV感染可能有一定的影响[4649]。总之，HPV感染能否导致宫颈肿瘤，在于HPV与宿主细胞内外环境多种因素相互作用后的严格选择[6]。

　　4 小结

　　普遍接受的宫颈肿瘤发生发展的病理过程是：HPV 感染宫颈基底细胞→低级CIN→ 高级CIN→浸润癌。近20多年来大量的流行病学、临床病理和实验室研究资料表明HPV感染在宫颈肿瘤发生发展的病理过程中起重要作用。近年来的研究主要集中在HPV癌基因E6和E7，已揭示E6和E7蛋白是多功能蛋白，主要是分别结合和灭活p53和pRb，导致细胞周期调控混乱、染色体不稳定、基因扩增和丢失、基因突变等，从而促使宫颈肿瘤的发生发展。HPV导致宫颈肿瘤的发生发展的病理机制包括持续性感染、E6和E7表达和功能的改变、HPV整合至宿主细胞DNA, 其中以E6和E7基因的表达和功能改变为中心。E6和E7表达水平和功能状态甚至可能决定CIN进退和浸润癌恶性性状的维持及演进。但帮助和介导E6和E7蛋白决定CIN进退和浸润癌恶性形状的维持和演进的分子标志及机制还不清楚。进一步研究与E6和E7蛋白相互作用的分子及其机制仍是当前在宫颈癌研究中最活跃的方向之一。

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