人高迁移率族蛋白突变体抗炎效应的初步研究

【摘要】  目的 构建6个高迁移率族蛋白1(high mobility group1 protein,HMGB1)突变体，从中挑选出与靶细胞膜上受体分离但没有致炎效应的突变体蛋白，并检测其在体外竞争性抑止HMGB1致炎效应的作用。办法 在已胜利制备HMGB1及其6个重组HMGB1突变体蛋白的根底上，对目的蛋白停止了有效纯化。采用细胞免疫荧光标志、激光共聚焦显微镜挑选出能与THP1细胞膜上受体分离的突变体。再经过ELISA挑选出没有致炎效应的突变体。进一步挑选出能在体外竞争性抑止HMGB1致炎效应的突变体。结果 挑选出的HMGB1 M1、M2、M3、M5能在体外竞争性抑止HMGB1的致炎效应，其中M1、M2竞争性抑止作用最强。结论 胜利挑选出在体外竞争性抑止HMGB1致炎效应的重组突变体，为抗炎治疗提供新型候选制剂。

           翘楚医学论文网:专业提供医学论文的写作、修改、翻译、发表      
           官方网站：https://www.qclunwen.com     服务QQ：55755004      
           邮箱：55755004@qq.com            咨询电话：18986130979        
           服务宗旨:原创、专业、诚信、安全可靠

【关键词】  高迁移率族蛋白； 突变； 表达； 蛋白纯化； 炎症因子

     Preliminary study on antiinflammatory effect of human  HMGB1 protein mutants  CHEN Jing, YUAN Zhiqiang, PENG Yizhi. Burn Institute of Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    Corresponding author: YUAN Zhiqiang, PENG Yizhi, Email: cqburn@yahoo.com.cn

    【Abstract】  Objective  To design and prepare 6 recombinant mutanthuman high mobility group box 1 (HMGB1) proteins and select the mutants that can combine with HMGB1 receptors but cannot produce inflammation to detect their competitive inhibition on the inflammatory effect of HMGB1. Methods   The mutants were effectively purified after cloning HMGB1 and 6 recombinant mutant HMGB1s. The mutants that could combine with HMGB1 receptors on the target cellular membrane were selected under confocal microscopy by immunofluorescence. The mutants that could not induce inflammation were selected with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).The mutants with competitive inhibitive effect on inflammatory effect of HMGB1 in vitro were further confirmed.Results  The selected HMGB1 M1, M2, M3 and M5 could competitively inhibit inflammatory effect of HMGB1 in vitro. Of all, HMGB1 M1 and M2 had the strongest effect of competitive inhibition.Conclusions  Mutants that can competitively inhibit inflammatory effect of HMGB1 in vitro are successful selected, as may cater a new potential agent for antiinflammation therapy.

    【Key words】  High mobility group1 protein;  Mutation;  Expression;  Protein purification;

    Inflammatory factor

    高迁移率族蛋白1(high mobility group1 protein,HMGB1)是一种在真核细胞中普遍表达并且高度激进的蛋白。最近研讨证明，HMGB1是晚期(或宽治疗窗口期)关键的致炎因子。HMGB1能被激活的免疫细胞释放到细胞外环境 ［1-4］，在全身性炎症及脓毒症的发作、开展中起重要作用。本实验旨在经过突变的HMGB1与自然HMGB1竞争分离相应受体而抑止其致炎效应的研讨，为抗炎治疗提供新型候选制剂。

    1  资料与办法

    1.1  资料

    1.1.1  试剂：IPTG为上海Sagon公司产品；低分子量蛋白Marker为上海生化所产品；蛋白纯化用缓冲液(Lysis Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer)、TE缓冲液为西南医院烧伤研讨所配制；Ni2+NTA层析系统为德国Qiagen公司产品；人HMGB1抗体为Santa Cruz公司产品；FITC标志兔抗羊多克隆抗体为中杉公司产品；IL1β ELISA试剂盒为晶美公司产品。

    1.1.2  细胞： THP1细胞由西南医院烧伤研讨所提供。

    1.2  办法

    1.2.1  人HMGB1的克隆：依照文献［7］办法制备。

    1.2.2  人HMGB1突变体的构建：依照文献［8］办法制备。

    1.2.3  表达载体的构建及目的蛋白表达：依照文献［8］办法停止。

    1.2.4  目的蛋白审定(Western blotting)：依据文献［8］办法停止审定。

    1.2.5  目的蛋白的别离纯化：(1)目的蛋白的大量表达。分别将含有重组原核表达质粒pQE80L/HMGB1及其M1～M6型的大肠杆菌DH5α接种于5 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培育液，37 ℃、225 r/min振荡过夜。再将菌液按1%分别接种于200 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培育液，37 ℃猛烈振荡3～4 h，直至OD600在0.6～0.8之间。参加诱导剂 IPTG 至终浓度 1 mmol/L。继续在37 ℃振荡使细菌生长4 h。4 ℃、4000×g离心15 min搜集细菌。(2)目的蛋白的别离。每克细菌参加3 ml TE buffer(pH8.0)。参加PMSF至终浓度为1 mmol/L。在冰浴中超声碎菌直至黏稠的菌液变清亮。参加PMSF至终浓度为1 mmol/L。4 ℃、4 000×g离心15 min，搜集上清液(经审定目的蛋白是以分泌方式表达)。(3)目的蛋白的纯化。将所搜集的各纯化后蛋白溶液各取100 μl，参加等体积2×SDSPAGE缓冲液，沸水浴10 min，取20 μl停止SDSPAGE电泳。(4)透析脱盐。(5)目的蛋白装入洁净的平皿中，冷冻抽干直至成为白色粉末。将白色粉末置-70 ℃保管、备用。

    1.2.6  激光共聚焦：将生长至对数生长期的THP1细胞，PBS洗濯1次，用适量无血清培育基悬浮细胞，参加24孔板中，每孔细胞数约为106个。每孔中分别参加多黏均素B至终浓度到达10 μg/ml。再分别参加纯化的M1～M6突变体蛋白，以及阳性对照(HMGB1)和阴性对照(PBS)，使各种蛋白终浓度为20 μg/ml。置细胞培育箱中孵育4 h后取出，参加PBS配制的2%多聚甲醛冰上固定30 min，将细胞转入EP管中，3 000×g，离心1 min，去上清液，用PBS洗濯2次。再参加200 μl 5% BSA封锁液重悬细胞，37度孵1 h。离心去上清液，用PBS洗2次。分别参加1∶100一抗稀释液100 μl，4 ℃ 1 h。用PBS洗2次。分别参加1∶100二抗稀释液100 μl，4 ℃ 40 min。PBS洗2次后置激光共聚焦显微镜下察看细胞膜上荧光。

    1.2.7  IL1β ELISA实验：细胞洗濯后参加各孔，每孔细胞数约为106个，参加多黏菌素，然后分为8组：1～6组中分别参加M1～M6蛋白，第7组为阳性对照(HMGB1蛋白)，第8组作为阴性对照(PBS)，各组蛋白终浓度均为20 μg/ml。每组分别于2、4、6、8 h 4个时相点搜集参加不同蛋白的THP1细胞悬液上清，行ELISA检测。

    1.2.8  竞争性抑止实验：细胞洗濯后参加各孔，细胞密度约为3.3×106/ml，参加多黏菌素。除阴性对照组(PBS)，其他各组均参加HMGB1至终浓度为20 μg/ml。再参加由IL1β ELISA实验挑选得到的只与受体分离而不诱导炎症因子的突变体蛋白，HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6，蛋白终浓度为20 μg/ml。分别于2、4、6、8 h 4个时相点搜集各孔中细胞悬液上清，行ELISA检测。

    1.3  统计学剖析

    数据以±s表示，采用统计处置软件SPSS停止t检验。P<0.05为差别有统计学意义。

    2  结果

    2.1  目的蛋白的别离、纯化

    超声碎菌后的上清液经Ni2+NTA柱纯化，然后各重组蛋白分别取样行SDSPAGE，可见各重组蛋白得到有效别离纯化，见图1。

    1.Protein Marker；2.重组蛋白HMGB1 M1；3.重组蛋白HMGB1 M2；4.重组蛋白HMGB1 M3；5.重组蛋白HMGB1 M4；6.重组蛋白HMGB1 M5；7.重组蛋白HMGB1 M6；8.重组蛋白HMGB1

    图1  各重组蛋白纯化后SDSPAGE电泳图片

    2.2  激光共聚焦荧光图像

    阳性对照组细胞膜上可见绿色荧光，而阴性对照组细胞膜上绿色荧光较弱。分别参加M1～M6 6个突变体蛋白的THP1细胞膜上均可见明显绿色荧光，见图2～7。

    2.2  IL1β ELISA实验结果

    阳性与阴性对照组在每个时相点都有差别(P<0.05)。M4组细胞上清液在8 h时相点IL1β含量显著高于阳性对照组，其他各组IL1β含量都低于阳性对照组，其中除M6组外，余各组在某些时相点与阳性对照组比拟差别有统计学意义(P<0.05)。见图8。

    2.3  竞争性抑止实验结果

    阳性与阴性对照组在每个时相点比拟差别均有统计学意义(P<0.05)。HMGB1 M6组在各时相点，其细胞上清中IL1β含量都明显高于阳性对照组，其他各突变体组2～6 h细胞上清液中IL1β含量与阳性对照组比拟差别无统计学意义(P>0.05)，但在6～8 h均能明显抑止HMGB1诱导IL1β的表达。其中HMGB1 M2组细胞上清液中IL1β含量最小，在6、8 h时相点均明显低于阳性对照组(P<0.05)。见图9。

　　3  讨论

    3.1  HMGB1—重要的晚期炎症介质

    已有研讨标明细胞外的HMGB1能惹起炎症反响，参与感染和炎症的病理进程［5，8-9］。一些研讨标明关于与脓毒症有关的致死性多器官功用衰竭，HMGB1是一个必需的重要的中间介质［9-11］。

    在TNFα浓度峰值呈现以后运用抗HMGB1抗体，也能够维护小鼠免于死亡［5］，在炎症发作后24 h给予乙基丙酮酸盐(在体内实验中可抑止HMGB1产生的)，能够延长脓毒症小鼠模型的存活时间［8］，进一步证明HMGB1作为一个晚期炎症因子在炎症竞争性抑止实验结果发作、开展中发挥重要作用。这也提示HMGB1的窗口治疗期比其他早期炎症因子更宽。鉴于HMGB1是全身性炎症及脓毒症级联反响中的晚期关键炎症因子，且其治疗窗口期长，使得该分子成为防治全身性炎症及脓毒症措施中一个重要靶标。

    3.2  目前针对HMGB1的抗炎制剂

    首先报道的研讨是，针对HMGB1的兔多克隆抗体，用于LPS诱导的内毒素血症中能有效地阻止内毒素血症招致的死亡，减缓内毒素惹起的关节炎［12-14］。但HMGB1抗体并不能明显改动由LPS诱导的TNF、IL1β、IL8、MIP的表达程度［15］。这也阐明HMGB1是一个独立的炎症介质。除了抗HMGB1抗体，目前还有两种不同的拮抗剂，HMGB1 A Box和乙基丙酮酸酯。目前，A Box的治疗作用曾经在盲肠结扎穿孔模型和关节炎模型中得到评价［16］。这提示A Box蛋白具有潜在的治疗作用，但A Box是小蛋白或小肽，其半衰期短，需反复给药。在盲肠结扎穿孔模型中发现，乙基丙酮酸酯能减少小鼠死亡率，即便当腹膜炎发作后24 h，给予乙基丙酮酸酯仍能有效发挥作用。除了对这两类抑止剂停止完善外，还需开展新型HMGB1抑止剂。

    3.3  结论及意义

    研讨标明，向培育的人单核细胞中参加纯化的重组HMGB1能够明显刺激细胞因子IL1β的释放，并且呈明显的剂量依赖性关系。本实验在胜利构建、制备、审定、纯化重组人HMGB1蛋白及其6个突变体的根底上，应用激光共聚焦的办法挑选出能与THP1细胞膜上受体分离的突变体，结果提示M1～M6 6个突变体都能与靶细胞THP1细胞膜上受体分离。分别参加各突变体蛋白与靶细胞THP1共同孵育后搜集上清液行ELISA检测IL1β含量，发现HMGB1 M4在6～8 h促炎作用较强，以至大于阳性对照，其他各突变体均明显低于阳性对照组(P<0.05)，与阴性对照组比拟差别无统计学意义(P>0.05)。因而经IL1β ELISA实验结果可初步挑选只与膜受体分离而不诱导炎症因子扫除HMGB1 M4。竞争性抑止实验提示，2～6 h各突变体组细胞上清液中IL1β含量与阳性对照组均无明显差别，但6 h以后各突变体的作用呈现出了区别。在6 h以后参加HMGB1 M6组细胞上清液中IL1β含量明显高于阳性对照组，因而M6不能竞争性抑止HMGB1诱导IL1β的表达。其他各突变体蛋白和HMGB1蛋白与THP1细胞共同孵育后，于6 h以后上清液中IL1β含量有低于阳性对照组的趋向，特别是HMGB1 M2，其IL1β程度于6、8 h两个时相点都显著低于阳性对照组(P<0.05)。从而取得了既能与自然HMGB1蛋白受体分离却没有致炎效应，能竞争性抑止HMGB1致炎效应的4种突变体：HMGB1 M1、HMGB1 M2、HMGB1 M3、HMGB1 M5。特别是HMGB1 M2对HMGB1致炎效应的竞争性抑止作用最显著。因而，本实验有望研制出针对炎症晚期的新型的抗炎候选制剂。

【参考文献】
  ［1］ Abraham E, Arcaroli J, Carmody A, et al. HMG1 as a mediator of acute lung inflammation. J Immunol,2000,165(6):2950-2954.

［2］ Czura C J, Wang H, Tracey K J. Dual roles for HMGB1: DNA binding and cytokine. J Endotoxin Res,2001,7(4):315-321.

［3］ Wang H, Bloom O, Zhang M, et al. HMG1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science,1999,285(5425):248-251.

［4］ Yang H, Wang H, Tracey K J. HMG1 rediscovered as a cytokine. Shock,2001,15(4):247-253.

［5］ Czura C J, Tracey K J. Targeting high mobility group box 1 as a lateacting mediator of inflammation. Crit Care Med,2003,31(1 Suppl):46-50.

［6］ 陈婧，袁志强，彭毅志.高迁移率族蛋白B1 cDNA的克隆与表达.创伤外科杂志，2007，9(1)：32-35.

［7］ 陈婧，袁志强，彭毅志.人HMGB1的分子改建及原核表达.第三军医大学学报，2007，29(7)：572-575.

［8］ Ulloa L, Batliwalla F M, Andersson U, et al. High mobility group box chromosomal protein 1 as a nuclear protein, cytokine, and potential therapeutic target in arthritis. Arthritis Rheum,2003,48(4):876-881.

［9］ Lotze M T, Tracey K J. Highmobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol,2005,5(4):331-342.

［10］Ulloa L, Tracey K J. The “cytokine profile”: a code for sepsis. Trends Mol Med,2005,11(2):56-63.

［11］Riedemann N C, Guo R F, Ward P A. Novel strategies for the treatment of sepsis. Nat Med,2003,9(5):517-524.

［12］Scaffidi P, Misteli T, Bianchi M E. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cellstriggers inflammation. Nature,2002,418(6894):191-195.

［13］Treutiger C J, Mullins G E, Johansson A S, et al. High mobility group 1 Bbox mediates activation of human endothelium. J Intern Med,2003,254(4):375-385.

［14］Palumbo R, Bianchi M E. High mobility group box 1 protein, a cue for stem cell recruitment. Biochem Pharmacol,2004,68(6):1165-1170.

［15］Leavis H, Top J, Shankar N, et al. A Novel putative enterococcal pathogenicity island linked to the esp virulence gene of Enterococcus faecium and associated with epidemicity. J Bacteriol,2004,186(3):672-682.

［16］Zetterstrom C K, Bergman T, RynnelDagoo B, et al. High mobility group box chromosomal protein 1 (HMGB1) is an antibacterial factor produced by the human adenoid. Pediatr Res,2002,52(2):148-154