关于噬菌体展示技术在血栓与止血方面的应用分析
【摘要】 血栓是血液成分在血液循环中于血管或心脏内膜外表构成的血液凝块或堆积物，招致循环障碍。噬菌体展现技术是将编码外源编码序列插入改建噬菌体载体的外壳蛋白基因中，以交融方式共同表达与噬菌体外表的一种技术，是一种高效的挑选体系。本文简介了相关方面的技术运用与研讨停顿。
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【关键词】 血栓与止血;噬菌体展现技术;血栓构成;综述
【Abstract】 Thrombosis is a blood component which formed blood clots or sediment on the surface of the intima in blood vessels or the heart in the blood circulation, leading to circulatory disturbance. Phage display technology is to insert the coding sequence encoding conversion of exogenous phage coat protein gene carrier to form a common expression of fusion phage of a technology, is a highly efficient screening system. This paper describes the use of related technical and research progress.
【Key words】 thrombosis and haemostasis;phage display;thrombophilia;review
血栓、止血与临床各科之间的联络和浸透都十分严密，从基因程度说明那些遗传性和先天性，以至某些取得性血栓和出血疾病的发作开展机制曾经成为当今该范畴的研讨潮流。噬菌体展现技术将外源蛋白交融表达于噬菌体颗粒外表，展现的外源多肽可坚持相对独立的空间构造和生物活性。这无疑为血栓与止血学的深化研讨提供了强大的工具。
1 噬菌体展现技术的原理及在血栓与止血方面应用特性概述
1.1 噬菌体展现技术的原理
噬菌体作为一种病毒，具有侵入宿主细胞，表达本身衣壳蛋白停止自我复制的才能。应用噬菌体衣壳蛋白基因的特性将编码外源多肽或蛋白质的基因与噬菌体衣壳蛋白基因交融，从而使需求表达的多肽或蛋白质以交融蛋白的方式展示在噬菌体外表，而被展现的多肽可坚持相对的空间独立性和生物学活性[2]。再经过亲和富集等办法挑选表达特异的蛋白或多肽的噬菌体，最后经过宿主菌把特异性蛋白或多肽表达出来。
1.2 在血栓与止血方面的应用特性
由于该技术最大的优点就是直接将基因型和表型，分子分离活性与噬菌体的可扩增性联络到一同，经过配体的特异性亲和力或与特异性酶分离剪切性，取得所需求的多肽或蛋白。因而，它在血栓与止血范畴中十分适用于凝血系统与抗凝系统的相关蛋白间互相作用研讨、相关因子的抗原剖析和抗体制备、多肽类抗凝药与止血药的研发及血栓与出血性疾病的临床早期实验室诊断技术等方面的普遍研讨与应用。
2 噬菌体展现技术在出血性疾病中的应用与开展
2.1 关于血小板的膜受体、抗体及其相关疾病的研讨
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是最常见的本身免疫性出血疾病，但分子级的相关本身抗体晓得的却很少。因而，ITP的诊断性实验和治疗缺乏特异性[3]。为了防止传统的B细胞无限增值法招致的技术缺陷Jessica H. Roark[4]等克隆全部组基因，克隆了血小板本身抗体;并检测了免疫球蛋白基因的用法，克隆构成才能和抗体特异性。噬菌体展现文库是由2个慢性ITP病人的脾细胞建成，并且细胞外表竞争性挑选被用来别离几组共同的lgG血小板特异性本身抗体。综合研讨结果标明：由遗传限制性和高特异性轻重链产物的分离而纯系扩张的B细胞产生的多种多样血小板抗体决议着与ITP相关的血小板活性抗体的开展。ADAMTS13富半胱氨酸域/距离域含有一段主要与取得性TTP(血栓性血小板减少性紫癜Thrombotic Thrombocytopenic Purpura)病人抗体分离的位点。为了研讨这种抗体的异质性对富半胱氨酸域的反响，B.M.LUKEN[5]等构建了V基因免疫球蛋白噬菌体库用来从一位取得性TTP病人的免疫球蛋白谱中别离单克隆抗ADAMTS13抗体。衔接可变区重链和轻链，表达成单链抗体与含有脱整联蛋白/血小板反响素1/富半胱氨酸域/距离域的ADAMTS13片段停止分离挑选。剖析得到的单链抗体提醒出多功用B细胞克隆产生的抗体直接作用于距离域是可行的，同时标明具有类似抗原特异性的抗体也存在于其他取得性TTP病人中。血小板膜受体的单克隆抗体曾经被普遍地应用于剖析受体构造和功用。人功用阻断性抗体曾经被用于抗血小板药物的研发。Y.Hagay[6]等从用丝状噬菌体展现的单链抗体库中经过挑选全部的血小板别离了人相关单克隆抗体。他们得到八条不同的与血小板分离的抗原。有两条能够被纯化作为scFV(单链抗体)，并且它们互相竞争分离到完好的血小板上。这些数据标明了从人scFvs噬菌体库用全血小板挑选能够用于别离功用性抗血小板GPIb抗体，这将有利于开展新的血栓治疗与诊断的战略。
2.2 在各型血友病中的应用
在取得性血友病中与VⅢ因子凝结的多克隆本身抗体(阻断剂)被制造出来了。Christoph Kessel[7]等用噬菌体随机肽库在病人的血浆中挑选模仿表位小肽以审定阻断剂抗原表位。取得的肽段序列与FVⅢ上A2和A1区域构象分离。随着更多的病人标本被挑选剖析，更多的FVⅢ的免疫决议域被晓得。这不只可用于取得性血友病，同样也可与A型血友病相对比。Edward N. van den Brink等用V基因噬菌体展现办法对人抗FVⅢ抗体停止分子剖析，鉴别出一段紧接着A2区酸性区域的新抗原表位[8], 也用该办法从VH1种系基因中找到了人对FVⅢ的C2区特异性抗体[9]。
3 噬菌体展现技术在血栓构成与血栓性疾病中的应用与开展
β3-整合蛋白参与经由αⅡbβ3[glycoprotein (GP)IIb-GPIIIa]的血小板积聚，并在血管再生中是经由内皮αvβ3。有抗汇集和促血管生长作用的穿插反响配体(这两种反响在外周血管疾病中有令人称心的效果)。为了研讨体内外两条人重组Fab片段的抗汇集和促血管生长作用，特别是β3-整合蛋白，R. ESCHER[10]等经过噬菌体展现技术取得重组Fab片段。察看到了在无血小板活性条件下，两条人Fab本身抗体片段与一段完好GPIIb-GPIIIa受体分离的特异性和高亲和力。剂量依赖性纤维蛋白原与GPIIb-GPIIIa分离及血小板汇集被完整抑止了。找到了第一条有全部抗汇集性质的完整人抗GPIIb-GPIIIa的Fab片段，并且不激活血小板。这条片段的研讨取得可能代表了一种新的工具对外周血管血栓病的研讨。
血小板糖蛋白Ibα与VWF的互相作用是血小板黏附的一个早期重要反响。血小板与胶原分离的直接方式是经过胶原的α2β1受体，糖蛋白IV和VI。间接的方式是在胶原与血小板vWF受体(GPIb/IX/V复合物)间vWF构成一座桥。这两种方式都是维持血小板在高剪切力下粘附性所必需的[11]。Paul A. McEwan[12]等报道了一种介于GpIbα和一强力阻滞肽间复合物的构造。这条肽段局限于与vWF分离域堆叠。它有效地起抑止作用是经过稳定一段在vWF分离域上构成扩展的β发夹构造的调理环的可交替α螺旋构造。这段构造明白了一条先前未被辨认出的GPIbα分离域并且表现出了一种可开展作用于GPIbα-vWF变构作用的抗血小板靶向制剂。镰刀红细胞对血管内皮细胞及皮下基质的高粘附性可能在镰刀红细胞血管闭塞的发病机制中起到重要作用。为了取得与凝血酶敏感蛋白(TSP)分离的抗体，Nicholas A.Watkins[13]等挑选了展现在丝状噬菌体外表的人scFVs高多样性文库。经过三轮的淘选，6条能与纯化TSP分离的共同scFVs被用ELISA别离出来。这为镰刀红细胞与TSP黏附时这段区域的作用提供了根据。
4 噬菌体展现技术在血栓与止血预防与治疗中的应用与开展
(胶原)Collagen-vWF-GPIb/IX/V轴在血栓构成中起到很重要的作用，它表现出一种具有可开发前景的新型抗凝药的目的。T.SZANTO等[14]用一随机直线型七肽库来挑选审定了可能干扰vWF-collagen绑定的小片段。他们得到了一个和vWF具有特异的并且有剂量依赖性的分离方式的克隆体。继续研讨证明了这是第一条与vWFc区分离的拮抗多肽，并能在高剪切力下抑止血小板的黏附与汇集;这条肽链有望开发为可口服的主导抗凝产品。像很多其他酶一样，属于凝血酶/胰蛋白酶家族的成员，存在与特定的酶激活段分离时的特异性选择问题。因而，这类抑止性药物就可能会增加不良药物和高反作用的风险。Dennis[15]等经过自然肽的噬菌体库找到了抗凝肽段。它与VIIa因子激活段明显区别的一段结实分离。这种展现或许是一类能够处理这类问题的办法。肝素被普遍用作抗凝剂。Els M. A. van de Westerlo[16]等运用噬菌体展现技术挑选了半合成scFV文库no.1，取得了19条共同的人抗肝素抗体。选择半合成文库的优势在于GAGs包括肝素很大水平上没有免疫原性，因而运用平常抗体产生技术普通很难胜利。抗体在肥大细胞内是有与肝素反响活性的。噬菌体抗体库的挑选提供了共同的工具用来研讨肝素及相关GAGs构造、位点和功用;并且有的结果可用作阻断剂运用。
5 噬菌体展现技术在血栓与止血实验室检查中的应用与开展
HIV-1相关血小板减少症(HIV-1-ITP)是常见的HIV-1感染的并发症。Klaus Koefoed[17]等用从由3个HIV-1-ITP病人免疫血清构建的免疫球蛋白G噬菌体文库，别离出一大组经过未固定血小板挑选的人单克隆抗体。由于暴露了的talin-H免疫显性表位可作为疾病相关进程的结果。talin-H抗体和相关的免疫复合物会对HIV-1-ITP的诊断提供价值。
6 噬菌体展现技术在血栓与止血方面研讨应用的瞻望
噬菌体肽库技术将传统的表位研讨大大简化。将抗体作为受体暴露于肽库中,挑选并剖析所得到的能与特异性抗体相分离的重组噬菌体肽的序列,再经过与抗原序列相比拟,也就得到了抗原决议簇的定位。该办法用于定位VWF、受损的血小板及特异性抗FVⅢ抗体的抗原表位，得到特异性小肽分子与患者体内的抗体相分离，就能够快速、高特异性地诊断相关疾病或中和某些抗体，用于治疗免疫性疾病[18]。固然目前该类诊断与治疗试剂用于临床还较少，但如上所述，研讨者们正在以分子程度不时开发具有普遍诊断和治疗价值的免疫优势抗原表位。
噬菌体抗体库可不经过免疫直接应用抗原筛库，其容量大，挑选才能强，可直接克隆得到抗体基因使得人源化单抗容易制备[19]。血小板的黏附、汇集、释放是血栓构成的重要环节。拮抗血小板膜糖蛋白对防治血栓性疾病具有重要意义。 固然噬菌体技术不能停止氨基酸的修饰，只能合成 L型氨基酸，不能对蛋白质停止糖基化加工，密码子表达偏性，库容量限制[20]，较长的外源肽段易随机折叠等许多缺乏，但置信随着该技术的不时开展和自我完善，其在血栓与止血范畴的运用价值也会不时增加，诊断治疗性产品最终会走向临床。
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