台盼兰染色肿瘤细胞化学药物敏感实验的临床应用价值

　【摘要】 目的：寻找一种简便、易行、费用低廉的肿瘤细胞化疗药物敏感实验方法，并用于指导临床用药。方法：对60例大肠癌患者的癌细胞进行体外有药培养，然后通过台盼兰染色检测细胞活动性的有关指标，确定最佳药物及组合，对病人进行化疗。追踪病人的生存率。结果：实验组的1、2、3、5年生存率分别为96%，83%，70%，43%。对照组的1、2、3、5年生存率分别为93%，73%，60%，33%。具有显著的差异。结论：①该法是一种简便、易行、费用低廉的肿瘤化疗药物敏感实验方法。②该法是具有临床指导价值的方法。  

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　　【关键词】 台盼兰; 肿瘤细胞; 化疗药物; 药敏试验; 临床应用

　　Clinical Value of Trypan Blue Coloring Method in Tumor Cell Chemosensitivity Assay

　　YANG Wei-xiong, ZHONG Hua, LI Ding-ming, et al

　　(The People’s Hospital of Maoming, Guangdong Maoming 525000, China)

　　Abstract： Objective: The purpose of this article is to find a simple, easy and low-cost tumor cell chemosensitivity assay, then guiding the use of clinical medicines. Method: The cancer cells of 60 cases of colon cancer patients were cultured with drug outside body. The relevant indexes concerning the cell activities were checked by trypan blue coloring method, then deciding the best drugs and combination and carrying out chemotherapy on patients. A follow-up survey had been made on the survival rate. Result: The survival rates for the 1st, 2nd, 3rd and 5th years in experimental group were respectively as follows: 96%, 83%, 70% and 43% and those in control group were respectively as 93%, 73%, 60% and 33%, in which the differences were obvious. Conclusion: ①The method is simple, easy and low-cost for tumor cell chemosensitivity assay. ②The method is valuable in clinical guidance.

　　Key words： Trypan blue; Tumor cell; Medicines for chemotherapy; Chemosensitivity assay; Clinical application

　　目前肿瘤已成为人类的第二大杀手，如何提高肿瘤病人的生存期是许多科技工作者孜孜以求的目标，而提高化疗药物对肿瘤的敏感性是我们追求的目标之一。为了能寻找一种对临床用药具有指导意义且简便易行、费用低廉的肿瘤细胞敏感实验，我们于2004年2月至2007年12月，选择符合研究条件的60例大肠癌病人进行研究，报告如下：

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料：收集2004年2月至2007年12月在本院手术治疗的大肠癌(经病理确诊)患者60例标本。随机分成实验组(A组，30例)及对照组(B组，30例)(见表1)，60例患者中最小年龄25岁，最大年龄65岁。

　　1.2 材料：RPMI：1640培养液和胰蛋白酶血清(杭州四季青公司)，台盼兰染色剂(上海史瑞可生物科技有限公司)。化疗药物：环磷酰胺(CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司)，顺铂(DDP，南京制药厂有限公司)，氟脲嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司)，丝裂霉素(MMC，浙江海正药业股份有限公司)。

　　表1 两组病人的临床资料比较(略)

　　1.3 方 法

　　1.3.1 大肠癌切除术后，取肿瘤组织标本，在无菌条件下，剥离肿瘤组织的纤维、脂肪层及结缔组织。

　　1.3.2 用生理盐水将肿瘤组织清洗，再用头孢噻肟钠溶液(头孢噻肟钠4.0+生理盐水)清洗。

　　1.3.3 用剪刀将肿瘤组织尽可能剪成小碎块，过200目钢网后放入肿瘤组织解离酶液中，以1500r/min条件下离心20min，弃去上清液。

　　1.3.4 以PRMI-1640制成癌细胞悬液，在显微镜下计数，调整细胞浓度至20～40万/ml。

　　1.3.5 分别取2ml癌细胞悬液各加入不同浓度的化疗药物CTX，DDP，5-FU，MMC。药物浓度(TDC)分别为200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%，保持总体积为3ml，在37℃，5%CO2，95%湿度下孵育3～4d;同时设无药对照组(M0组)，取2ml癌细胞悬液加与化疗药物同等剂量的培养基，保持总体积为3ml，同等条件下孵育3～4d。

　　1.3.6 用台盼兰染色计数各组的活细胞数。用品：①4g台盼兰，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，制成1%台盼兰母液。使用时，用PBS(磷酸缓冲液)稀释至0.4%。②吸管、白细胞计数板、显微镜。 步骤：①染色：取9滴癌细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼兰液，混匀。②计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞(镜下观察，死细胞淡蓝色，活细胞拒染)。据下式求活细胞率： 活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞总数)×100。

　　1.3.7 测定AUG、IC50、IC90、SI等指标。

　　1.3.8 确定敏感药物并选出最佳药物或药物组合，对病人进行化疗。(实验组，A组)。

　　1.3.9 对照组(B组)病人用常规药物化疗。

　　1.3.10 追踪观察病人(A组及B组)的近期效果，肿瘤的复发、转移、3年生存率、5年生存率，评估疗效。

　　1.4 结果评估：①药物敏感定义：高AUC(抑制曲线下面积)值，低IC90(抑制90%癌细胞生长是的药物浓度)、IC50(抑制半数癌细胞生长时的药物浓度)和SI(敏感指数)值，和高TGI(癌细胞生长抑制)值(表示癌细胞生存100%抑制)。②药物耐受定义：低AUC值，高IC90、IC50和SI值，和低TGI值。③敏感度分级，定义为：强敏感：IC90 ≤100%TDC(测试肿瘤药物浓度)和IC50≤ 25%TDC。部分敏感：IC90>100%TDC和IC50≤ 25%TDC。弱敏感：IC90≤100%TDC和IC50>25%TDC。耐药：IC90>100%TDC和IC50≤25%TDC。

　　2 结果

　　实验结果显示，不同个体的(大肠癌)癌细胞对四种化疗药物具有不同的敏感性。汇总见表2。

　　表2 药物敏感实验结果(n=30)(略)

　　随访至2007年12月，以Mantel-Cox和Broslow方法进行生存率比较。A组：1年、2年、3年、5年生存率分别是96%、83%、70%、43%。B组：1年、2年、3年、5年生存率分别是93%、73%、60%、33%。两组比较具有显著差异(P=0.0225)，见图1。

　　图1 A组和B组患者生存曲线(略)

　　3 讨论

　　3.1 台盼兰染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼兰可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。注意：台盼兰染色细胞时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。

　　3.2 本实验的意义和优点：肿瘤细胞的增生与失凋亡之能力有关[1～5]，并且存在多种因素导致肿瘤细胞凋亡能力的丧失，逃避了凋亡肿瘤细胞对常规化疗药物耐药中所起的关键作用[6，7]。因此，寻找一种高效低毒的药物做为化疗或辅助化疗治疗肿瘤就是我们研究方向。本实验通过简易的化疗敏感实验确定对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物或药物组合。其意义在于：①选择和确定针对个体的敏感药物，提高疗效。②减少化疗的盲目性，避免无效药物对肌体的损害。③改善肿瘤病人的生存质量，延长生存期。④研发一种简便易行、费用低廉的实验方法以指导临床。本研究对癌症患者的癌细胞进行体外的有药培养，然后通过台盼兰染色检测细胞活性的有关指标，确定最佳药物及组合，具有以下优点：①费用低廉，避免ATP-TCA方法的费用昂贵的缺点。②避免HCTA法无法测定增殖G的细胞。③简便易行，对临床用药具有指导意义。

　　3.3 比较实验组(A组)和对照组(B组)的疗效：本研究中，A组通过药敏试验，选出敏感的化疗药物及组合，用于临床治疗，其1年、2年、3年生存率分别为96%、83%、70%、43%。B组用常规药物化疗，其1年、2年、3年生存率分别为93%、73%、60%、33%。两组比较P=0.0225，说明A组的疗效优于B组。药敏实验结果与临床疗效具有一致性。

　　本实验利用患者术后的肿瘤组织标本，制成癌细胞悬液，加入各种化学药物后进行培养，然后用台盼兰染色，计数各组的活细胞数，测定AUG、IC90、IC50和SI等指标，确定敏感药物并选出最佳药物或药物组合，对病人进行化疗。本实验表明：①该法是一种简便、易行、费用低廉的肿瘤化疗药物敏感实验方法。②该法是具有临床指导价值的方法。

　　【参考文献】

　　[1] Qin LX,Tang ZY.The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma[J].World Gastroenterol，2002，8:385-392.

　　[2] Tao HQ,Zou SC.Effect of preoperative regional artery chemotherapy on proliferation and apoptosis of gastric carcinoma cells[J].World Gastroenterol，2002，8:451-454.

　　[3] Liu S,Wu Q,Ye XF,Cai JH,Huang ZW,Su WJ.Induction of apoptosis by TPA and VP-16 is through translocation of TR3[J].World Gastroenterol，2002，8:446-450.

　　[4] Wu YL,Sun B,Zhang XJ,Wang SN,He HY,Qiao MM,Zhong J,Xu JY.Growth inhibition and apoptosis induction of sulindac on human gastric cancer cells[J].World Gastroenterol，2001，7:796-800.

　　[5] Huang J,Cai MY,Wei DP.HLA class I expression in primary hepatocellular carcinoma[J].World Gastroenterol，2002，8:654-657.

　　[6] 郭晓钟,邵晓冬,徐建华,等.肝癌组织中bcl-xL mRNA的表达[J].世界华人消化杂志，2002，10:530-532.

　　[7] 梁云,陆斌,崔贞福,等.肝细胞癌中Fas/FasL表达的意义[J].世界华人消化杂志，2001，9:1364-1368