噪声暴露后耳蜗凋亡与坏死毛细胞琥珀酸脱氢酶活性的变化

【摘要】  目的　提醒噪声暴露后耳蜗凋亡、坏死毛细胞线粒体功用的变化。办法　将灰鼠暴露于155 dB SPL的脉冲噪声75次，噪声暴露后5 h解剖取双侧耳蜗。采用琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）染色法停止耳蜗基底膜细胞线粒体染色，细胞核DNA荧光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）双重染色耳蜗基底膜，以未受噪声暴露动物为对照，显微镜下察看噪声暴露后耳蜗基底膜核固缩和核肿胀毛细胞琥珀酸脱氢酶染色的变化。结果　噪声暴露损伤区的耳蜗外毛细胞SDH着色变浅，蓝色颗粒物存在于PI标志固缩的耳蜗毛细胞核四周，而肿胀的毛细胞核四周短少SDH阳性染色物。结论　强脉冲噪声暴露后，凋亡的耳蜗外毛细胞仍然存在不同水平的线粒体功用，而坏死的外毛细胞线粒体功用受损严重。

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【关键词】  耳蜗；　毛细胞；　线粒体；　噪声；　凋亡；　坏死

      The changes of succinate dehydrogenase activity in the apoptotic and necrotic outer hair cells following impulse noise exposure

    YANG Wei－ping1, HU Bo－hua2

    1　Institute of Otolaryngology, Chinese General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

    2　Center for Hearing and Deafness, State University of New York at Buffalo, 137 Cary Hall,

    3435 Main Street, Buffalo, NY 14214, USA

    　　【Abstract】 Objective　To examine the changes of mitochondrial function in the noise-induced apoptotic and necrotic outer hair cells（OHCs）. Methods　Chinchillas were exposed to 75 pairs of impulse noise（1 second interval between each pair） at 155 dB pSPL. Five hours after the noise exposure, the cochleae were harvested. Mitochondria energetic function, succinate dehydrogenase（SDH） activity, in the hair cells（HCs） of cochleae was evaluated with a colorimetric assay using blue tetrazolium（NBT） monosodium salt. The SDH-labeled organs of Corti were double stained with propidium iodide（PI）, a DNA intercalating fluorescent probe used to visualize the morphologic viability of hair cell nuclei. All the specimens were observed with a microscope with bright field for SDH staining or epifluorescence illumination for PI labeling. Results　SDH staining appears around the OHCs showing nuclear condensation, a sign of apoptosis. The OHCs with the nuclear swelling, a sign of necrosis, lack SDH staining. Conclusion　The result of the study indicates that energetic function of mitochondria is preserved in the course of the apoptotic process， but seriously damaged in the course of the necrotic process.

    　　【Key Words】　Cochlea;　Hair cells;　Mitochondria;　Noise;　Apoptosis;　Necrosis

    　　强脉冲噪声暴露能够招致耳蜗基底膜毛细胞损伤。我们的研讨发现，噪声经过两种方式招致毛细胞死亡，即凋亡和坏死［1］。不同的细胞死亡方式存在截然不同的细胞形态学特征、生物学过程和对四周细胞的作用［2］。本实验进一步提醒强脉冲噪声暴露后凋亡、坏死毛细胞线粒体功用的变化，为噪声致毛细胞死亡机制及早期干预研讨提供实验 根据。

    1　资料与办法

    1.1　实验动物 

    　　成年灰鼠12只，雌雄不拘，动物均无强噪声暴露及耳毒性药物运用史，体重450 ～ 600 g，6只（12耳）受噪声暴露的动物为实验组，6只（12耳）未受噪声暴露的动物为对照组。

    1.2　噪声暴露 

    　　应用中心频率为 4 kHz 的窄带噪声。噪声由信号发作器（美国 loughborough TMS 32020）产生, 经功率放大器（美国 NAD 2200）放大，传至扬声器（美国 JBL 2360）。噪声暴露在隔声室内停止，扬声器放置于动物头前方的程度位3 cm 处，应用声级计（美国 Larson and Davis 825型）丈量噪声强度。给声强度为155 dB SPL，脉冲声暴露75次，每次1秒, 距离1秒。

    1.3　琥珀酸脱氢酶（SDH）染色

    　　噪声暴露后5小时，将CO2麻醉的动物断头，取出双耳听泡。暴露耳蜗，翻开耳蜗的卵圆窗、圆窗及蜗尖，自耳蜗圆窗迟缓灌注新颖配置的SDH染液（0.2 mol/L磷酸缓冲液，0.2 mol/L琥珀酸钠, 0.1% 氯化硝基四氮唑蓝，染液配置比例为 1：1：2），将灌注SDH染液的耳蜗置于含有相同染色液容器中，37°C孵育1 h。

    1.4　碘化丙啶（PI）染色

    　　10% 福尔马林固定SDH染色的耳蜗，于     10 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中别离耳蜗基底膜。将标本移入5 ?滋g/ml  PI(Molecular probes，Inc.，Eugene，OR，美国）染色液中（10 mmol/L PBS配制），室温避光反复染色10分钟。将PBS清洗后的标本平铺于载玻片。

    1.5　显微镜下察看及计算机图像处置

    　　以未受噪声暴露的动物为对照，普通光源显微镜下察看耳蜗基底膜毛细胞线粒体SDH染色的区域、显色的水平。荧光显微镜下察看PI染色的毛细胞核形态学变化。共聚焦显微镜（Bio-Rad, MRC 1024）下拍照，计算机图像处置系统叠加共聚焦显微镜采集的图像。

    1.6　凋亡、坏死的毛细胞鉴别规范

    　　凋亡细胞：PI染色的毛细胞核固缩，荧光染色加强。坏死细胞：PI染色的毛细胞核肿胀变形，荧光染色削弱［3］。

    2　结　果

    2.1　荧光显微镜下察看

    被红色PI染色的正常对照组动物耳蜗基底膜一排内毛细胞和三排外毛细胞核呈圆形，细胞排列有序，大小分歧，染色平均，外形规则，无细胞核缺失（图1A）。噪声暴露后5 h，损伤的毛细胞主要位于耳蜗基底膜的一回上和二回下区域， 外毛细胞损伤严重，内毛细胞构造完好。受噪声损伤的外毛细胞呈现核固缩、核肿胀和核缺失三种形态学变化。三排外毛细胞核排列紊乱，呈现外毛细胞核的片状缺失。多数散在的不同水平小球型固缩的外毛细胞核和少数肿胀的外毛细胞核散乱散布于损伤的外毛细胞区内（图2A）。

    2.2　普通光源显微镜下察看

    　　未承受噪声暴露动物的耳蜗基底膜毛细胞质内充溢密集的深蓝色颗粒沉淀物，SDH的活性呈强阳性，外毛细胞酶活性强于内毛细胞（图1B）。噪声暴露后的毛细胞SDH的着色变浅, 外形不规则，排列紊乱，存在片状无染色区（图2B）。

    2.3　计算机叠加图像察看

    　　计算机图像处置系统将共聚焦显微镜下采集的同一个视野的荧光和普通光源图像叠加后察看发现，噪声暴露后5 h 的耳蜗基底膜SDH蓝色颗粒物存在于PI标志固缩的耳蜗毛细胞核四周，而肿胀的毛细胞核四周短少SDH阳性染色物（图2C）。

    3　讨　论

    　　SDH是存在于细胞线粒体内膜的一种重要的氧化复原酶，由于其定位分明，已成为检测线粒体功用的标志酶［4-5］。本研讨发现，噪声暴露损伤区的耳蜗基底膜外毛细胞SDH着色变浅，标明脉冲噪声可招致外毛细胞线粒体功用受损。近年来，自在基在噪声性毛细胞损伤中起主要作用的观念已得到多数学者的公认［6］。线粒体既是细胞内停止氧化磷酸化产生能量的主要场所，又是细胞自在基生成的部位。由于线粒体内缺乏修复机制，因而对氧自在基作用最为敏感。脉冲噪声暴露后，强大的液体涡流冲击蜗管形成的耳蜗基底膜外毛细胞机械性的损伤和继发的氧自在基堆积惹起的代谢性损伤，可招致耳蜗外毛细胞线粒体功用降落。

    　　凋亡和坏死是噪声致耳蜗毛细胞死亡的两种方式。我们已完成的噪声致毛细胞死亡方式的系列研讨发现，噪声致毛细胞死亡是一个渐进的过程。强脉冲噪声暴露后10分钟耳蜗基底膜损伤区的外毛细胞呈现染色质移位及凋亡小体，30分钟可见到少量肿胀的外毛细胞核，6小时察看到局部微小球型固缩的外毛细胞核和片状外毛细胞核的缺失［7］。定量察看发现，外毛细胞凋亡为强噪声暴露后耳蜗基底膜细胞早期死亡的主要方式［8-9］，凋亡和坏死共同招致耳蜗基底膜损伤的进一步开展，噪声性毛细胞死亡过程至少持续至噪声暴露后30天［9］。本实验噪声暴露后5小时的灰鼠耳蜗基底膜同时存在坏死、缺失和不同阶段凋亡的外毛细胞，可以察看到不同死亡方式的耳蜗基底膜毛细胞线粒体SDH活性的变化。

    　　本实验察看了强脉冲噪声暴露后耳蜗基底膜凋亡、坏死的外毛细胞线粒体SDH染色的变化。结果发现，SDH活性存在于不同凋亡过程的外毛细胞，以至一些隐约消逝的微小球型细胞核和曾经消逝细胞核的部位，而坏死的外毛细胞则相反。研讨结果标明，线粒体功用与细胞的不同死亡方式亲密相关。强脉冲噪声暴露后，凋亡的耳蜗外毛细胞仍然存在不同水平的线粒体功用，而坏死的外毛细胞线粒体功用受损严重。有学者报道，凋亡是由细胞信号通路控制的一种细胞主动、耗能的死亡方式；而坏死是细胞对环境压力反响的一种细胞被动、非耗能的死亡方式，也可能由准确的细胞信号通路控制。细胞凋亡是依赖一类对天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（caspases）产生的级联反响，经过内源性或外源性途径停止。在内源性途径中，胞内死亡信号诱导线粒体膜通透性改动，失去跨膜电位，释放细胞色素C。胞浆内的细胞色素C与凋亡激活因子1（apoptosis activating factor 1, Apaf 1）、caspases 9 构成凋亡小体，活化的caspases 9切割caspases 3，最终招致细胞死亡；在外源性途径中，胞外死亡信号经过死亡受体转入胞内，与caspases 8构成死亡诱导信号复合体。Caspases 8经过寡聚而本身切割活化，激活下游的caspases 3，产生凋亡效应，此过程不需求线粒体的参与。细胞坏死则是以非caspase 依赖的方式死亡。

    　　Nicotera发现，细胞内能量代谢程度对细胞死亡启动方式及转换起到了重要的作用。细胞内ATP含量坚持在一定的阈值以上，细胞启动凋亡程序。而ATP含量在阈值之下，则细胞以坏死方式死   亡［10］。细胞内ATP主要在线粒体生成，线粒体释放细胞色素C是内源性细胞凋亡途径启动的关键步骤。因而，依据本实验结果推论，脉冲噪声暴露致轻度受损的耳蜗外毛细胞线粒体，仍能提供外细胞凋亡所需的能量，释放细胞色素C，启动凋亡程序，直至固缩细胞核的消逝。线粒体功用重度受损,不能提供细胞凋亡所需求的能量，细胞则以坏死方式死亡。线粒体功用的变化与噪声性凋亡、坏死的外毛细胞发作和开展的关系有待于进一步研　究证明。

【参考文献】
  1　Hu BH, Guo W, Wang PY, et al. Intense noise-induced apoptosis in hair cells of guinea pig cochleae. Acta Otolaryngol， 2000, 120 (1): 19-24.

2　Nicotera TM, Hu BH, Henderson D. The caspase pathway in noise-induced apoptosis of the chinchilla cochlea. J Assoc Res Otolaryngol, 2003, 4(4): 466-477.

3　杨卫平，胡博华. 耳蜗毛细胞凋亡早期的检测办法. 军医进修学院学报, 2005， 26(2): 122-123.

4　Chen GD, Mcwilliams ML, Fecher LD. Succinate dehydrogenase (SDH) activity in hair cells: a correlate for permanent threshold elevations. Hear Res, 2000, 145(1-2): 91-100.

5　Zhai S, Jiang S, Gu R, et al. Effects of impulse noise on cortical response threshold and inner ear activity of succinic dehydrogenase and acetylcholinesterase in guinea pigs. Acta Otolaryngol, 1998, 118(6): 813-816.

6　Henderson D, Bielefeld EC, Harris KC, et al. The role of oxidative stress in noise-induced hearing loss. Ear Hear, 2006, 27(1): 1-19.

7　杨卫平，于拂晓，胡吟燕，等. 脉冲噪声暴露后早期大鼠耳蜗外毛细胞死亡时程察看. 解放军医学杂志, 2006, 31 (6): 543-544.

8　Hu BH, Henderson D, Nicotera TM. Involvement of apoptosis in progression of cochlear lesion following exposure to intense noise. Hear Res, 2002, 166 (1-2): 62-71.

9　Yang WP, Henderson D, Hu BH, et al. Quantitative analysis of apoptotic and necrotic outer hair cells after exposure to different levels of continuous noise. Hear Res, 2004, 196(1-2): 69-76.

10　Nicotera P, Leist M, Ferrando-May E. Intracellular ATP, a switch in the decision between apoptosis and necrosis. Toxicol Lett, 1998, 102-103: 139-142.