大鼠血管纹边缘细胞永生细胞系的建立

【摘要】  目的 树立大鼠血管纹边缘细胞（Marginal Cells, MC）的永生细胞系，为进一步研讨MC的功用打下根底。办法　取3 ～ 5日龄大鼠的耳蜗侧壁组织停止MC的原代培育，经选择性消化、差别性贴壁等手腕纯化MC后，将MC和SV40在无血清DMEM条件下共培育三天，经2% 重生牛血清选择培育三天，经过形态学的变化及增殖才能的变化粗筛出MC系；经过察看MC系的形态、生长特征，细胞角蛋白18、波形蛋白的免疫细胞化学，RT-PCR检测SV40 T抗原、IsK，细胞记数法及流式细胞术剖析其生长状况及染色体倍型，软琼脂培育、裸鼠致瘤实验等审定MC-C3系。结果　MC-C3系根本坚持了原代MC的表型特征：多角形外观、细胞间衔接严密，单层时呈“铺路石样”外观，dome构成才能等形态、生长特征；细胞角蛋白18、波形蛋白表达双阳性；不同世代的MC-C3均有SV40 T抗原、IsK的表达。MC-C3为二倍体细胞。软琼脂培育和裸鼠致瘤实验阴性。该系目前已培育5月，超越20代，传代时间为4 ～ 5天，传代比例为1：2 ～ 3。液氮中保管有不同世代的细胞。结论　本实验胜利的树立了大鼠边缘细胞的永生细胞系，初步审定标明MC-C3根本保存了原代边缘细胞的表型特征，又不具有瘤细胞的特征。为边缘细胞功用的研讨，特别是电生理、分子生物学方面的研讨打下了良好的根底。

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【关键词】  　边缘细胞；　永生细胞系；　猿猴肉瘤病毒（SV40）；　IsK

    Establishment of immortal marginal cell line of the rat stria vascularis

    CHEN Min,  KONG Wei-jia

    Department of Otorhinolaryngology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong

    University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

    　　【Abstract】 Objective　To establish marginal cell（MC） immortal line originated from rats. Methods　The lateral wall tissues of rat pups’ cochleae were excised as explants for the primary culture of marginal cells. The purified MC was co-cultured with SV40 in serum-free DMEM for three days, then was chosen by 2% new born calf serum（NBCS） in DMEM for another three days. One population of MC was selected as the permanent MC line many times later. Immunocytochemical staining for cytokeratin 18 and vimentin, ultrastructural examination, reverse transcription PCR amplifying cDNA of MC T-antigen gene, the marker of immortalization, and IsK-protein gene, the unique marker of MC, flow cytometric analysis of MC’s DNA content, injection of the MC to nude mice and soft-agar-medium culture were used to identify the origin and characterization of MCs. Results　MC-C3 may grow into monolayer with “cobblestone-like” appearance and dome formation ability. MC-C3 co-expressed cytokeratin 18 and vimentin, showing its epithelial origin. mRNAs of SV40 large T antigen and IsK protein existed in the MC-C3. Flow cytometric analysis of this cell line’s DNA content was diploid. The test for neoplasm- inducing ability of MC-C3 was negative. It has been passaged 21 time. The passage interval was 4-5 days and the passage ratio was 1:2-3. Different passages of MC-C3 were kept at -196℃.  Conclusion　The MC line（MC-C3） has been successfully established. It kept the phenotype characterization of the primary MC, and did not contain the neoplasm behavior. So it is suitable for study of  the  MC function,  especially in electrophysiological and biomolecular aspects.

    　　【Key words】　Marginal cell;　Immortal cell line;　SV40;　IsK

    　　声音信号刺激时，内淋巴中的高浓度K+ 在高电位的驱动下进入毛细胞，改动毛细胞的电位，机械 – 电转导机制得以完成。目前研讨以为，血管纹的三种细胞都参与了内淋巴这种电化学特性的产生和维持，但边缘细胞（marginal cell, MC）在其中发挥的作用更为重要［1］。

    　　为进一步研讨MC的生理功用及在某些疾病中可能的作用机制，细胞培育成为一种重要的研讨手腕。但是原代培育的操作过程比拟复杂，不利于大范围应用；原代细胞较短时间会呈现“老化”，细胞的某些性状会发作改动；同时培育体系中混有一定数量的杂细胞，特别是成纤维样细胞（fiboblast-like cell, FLC），为纯化MC采取了无血清培育、重复消化等措施，都会影响细胞的活性及某些成分的含量。以此为实验资料，有可能得出错误的结论。

    　　永生化细胞系的树立可处理上述问题。树立细胞系有四个根本途径：原代培育细胞的自然突变、理化物质的诱发突变、原癌基因的整合（病毒或质粒）、肿瘤细胞的直接培育［2］。猿猴肉瘤病毒（Simian Virus，SV40），主要是大T抗原，已被胜利用于树立血管平滑肌细胞株（SV40 CF-SMC）、角化上皮细胞株（HE-TS，HE-TC）等多种永生细胞系，这些转化细胞株根本坚持了细胞原有的特征，被用于有关功用的研讨。随着基因工程技术的停顿，呈现了稳定表达SV40 T抗原温度敏感株tsA58的“永生性”小鼠［3］，成为一种树立细胞系的新办法。实践上，“永生性”小鼠的树立，理论上使各种永生细胞系的树立成为可能。

    　　1998年，Belyantseva等应用出生后14天的“永生化”小鼠的SV树立了上皮细胞系SVK-1，但缺乏MC的特异性标志物IsK。同年，另一个实验小组运用HPV-16的E6和E7基因树立了沙土鼠MC的细胞系MCPV-8。该系分化良好，具有特征性的上皮构造、IsK以及跨膜转运上皮的dome构成才能［4］。目前国内尚未见这方面的报道。

    　　本实验经过野生型SV40感染大鼠原代培育的MC，胜利树立了边缘细胞的细胞系（MC-C3），并经过形态学察看、免疫组化、分子生物学等技术对该系停止了审定，为MC的功用研讨，特别是通道、受体研讨打下了根底。

    １　材 料 和 方 法

    1.1　实验资料

    1.1.1　实验仪器

    　　CO2培育箱，超净工作台，恒温水浴箱，台式高速离心机，台式低温离心机，医用离心机，倒置显微镜及成像系统，解剖显微镜，普通光镜，扫描电镜 透射电镜，PCR扩增仪，琼脂糖电泳安装及凝胶成像剖析系统，-70℃ 冰箱，微量移液器。

    1.1.2　主要试剂及用处

    　　MEM（minimem essential medium, MEM）， DMEM（Dulbecco’s modified eagle media, DMEM），胎牛血清（fetal calf serum, FCS）， 重生牛血清（new born calf serum, NBCS）, Trizol， 购自Gibco Co.（美国）。氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸、霍乱毒素、表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）、 胰岛素—转铁蛋白—硒酸钠补充液（insulin–transferrin–selenic acid sodium， ITS）、二性霉素B （Fungizone）、 二甲基亚砜（DMSO），购自Sigma Co.（美国）。N-双（2-羟乙基）哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）（Roche Co.）。左旋谷氨酰胺(日本, 上海分装)。青霉素和链霉素(华北制药厂)。

    　　猿猴肉瘤病毒（Simian Virus，SV40）及非洲绿猴肾细胞系（CV1）（中国预防医学科学院病毒研讨所）。

    　　鼠抗人细胞角蛋白（CK18）单克隆抗体，鼠抗猪波形蛋白单克隆抗体（北京中山生物公司）。过氧化物酶标志的链霉卵白素试剂盒及DAB显色试剂盒（SABC，武汉博士德公司）。

    　　Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、cDNA第一链合成试剂盒,购自Fermentas Co.。DL-2000、琼脂糖凝胶回收试剂盒（Takara，日本）。焦磷酸二磷酸酯（DEPC），琼脂糖（西班牙进口产品分装）。

    　　用于边缘细胞培育的培育基有两种：完整培育基和MC-C3细胞系培育基。完整培育基的组成：MEM中参加20% FCS、 20 mmol/L HEPES、 2 m mol/L L-谷氨酰胺、 0.4 mg/L氢化可的松 、 5 μg/L 霍乱毒素 、 胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠补充液　　（1 ×） 、 0.2 mg/L 三碘甲状腺原氨酸、100 U/ml 青霉素、 100 mg/L链霉素、 二性霉素B 2.5 mg/L 、 10 μg/L表皮生长因子， pH 6.7 ～ 7.0。MC-C3细胞系培育基的组成： MEM中参加10% FCS、 20 mmol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 100 U/ml 青霉素、 100 mg/L链霉素、 二性霉素B 2.5 mg/L。

    　　与病毒增殖、转化有关的培育基有三种 ——转化培育基：DMEM中参加20 mmol/L HEPES、 2 m mol/L L-谷氨酰胺、 100 U/ml 青霉素、 100 mg/L链霉素； 维持培育基： DMEM中参加2% NBCS、 20 m mol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 100 U/ml 青霉素、 100 mg/L链霉素；生长培育基： DMEM中参加10% NBCS、 20 mmol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 100 U/ml 青霉素、 100 mg/L链霉素。

    　　消化液组成：0.25%胰蛋白酶（Sigma分装）和0.01%乙二胺四乙酸钠（EDTA）按1：1体积比混合。

    1.2　实验办法

    1.2.1　大鼠MC的原代培育

    　　3 ～ 5日龄Wistar大鼠，5只/次（华中科技大学同济医学院实验动物学部提供），戊巴比妥钠腹腔麻醉致死（100 mg/kg），75% 酒精浸泡10 ～ 15分钟；D－Hanks液（含10 × 双抗）充沛冲洗，投入新颖D-Hanks液中停止解剖：沿头颈相接处断头，眼科直剪沿枕骨大孔去掉大局部顶骨及全部脑组织，沿颞骨岩部的三角形界线取颞骨，牙科探针除掉鼓膜及四周软组织，可见透明的骨性耳蜗。在超净台中应用解剖显微镜解剖出透明的侧壁组织（大小不等，可见红色的毛细血管网， 3 ～ 7mm， 4 ～ 5段/耳蜗）。一切解剖操作都在冰上停止。用显微镊子将之转移至35 mm一次性塑料培育皿 （Nunc， 丹麦），参加数滴完整培育基， 保证一切的组织块（explants） 潮湿即可。入5% CO2 / 95%空气、 37℃ 培育箱。 24小时后当心补加约1 ml完整培育基， 以避免新近贴附的组织块漂起。培育基每周换两次。

    1.2.2　SV40的增殖

    　　取SV40的冰冻干粉，参加1 ml无血清的DMEM（含1 × 双抗和2 mmol/L左旋谷氨酰胺）后混匀。取0.1 ml， 稀释至1 ml， 则滴度为10-1； 依次稀释出滴度为10-2 ~ １０ -5的病毒液。

    　　CV1细胞接种到35 mm一次性塑料培育皿（0.8 ～ 0.9 × 105个/皿），第3天参加1 ml不同滴度（10-1 ～ 10-5）的含病毒培育基，另设阴性对照。每日用倒置显微镜察看， 当察看到50% 的细胞形态发作变化 —— 从正常的多角形变为梭形时，换维持培育基， 3天后换生长培育基。当细胞长满时，半数传代增毒， 半数收获SV40。收获详细过程如下： -20℃ 两小时， 室温下冻结，重复3次后离心，1 000 r/min，10分钟， 取上清， -70℃ 保管。一切与病毒有关的器物都经84消毒液原液浸泡3天后， 再常规处置。

    1.2.3　大鼠的MC原代和含SV40培育基的共培育

    取材于重生大鼠耳蜗的侧壁组织， 24小时后可见FLC和MC爬出组织块，重复运用选择性消化法和差速贴壁法（ABC法）纯化MC后， 将MC接种至24孔板， 同时或培育一天后参加含不同滴度（10-1 ～ 10-5）SV40的转化培育基培育3天，维持培育基挑选3天后， 换生长培育基3天，以后每3天换液一次。倒置显微镜每日察看细胞形态和增殖才能的变化。

    　　选择性消化法：将消化液参加培育皿中，应用FLC比MC对胰酶敏感， 先变圆、 脱壁的性质，适时终止消化， 悄悄吹打， 去掉大局部FLC。可屡次运用以到达最佳的纯化效果。

    　　差速贴壁法（ABC法）：应用MC比FLC贴壁速度慢的特性，将含有两类细胞的细胞悬液重复贴壁，使两类细胞互相别离。详细操作如下：参加消化液后，待细胞半数变圆时终止消化， 悄悄、 充沛吹打，制成平均的细胞悬液。 取编号为A、 B、 C的三组培育孔（24孔板），首先把细胞悬液接种至A组孔中，温箱中静置15 ～ 20分钟后，悄悄吸出尚未贴壁的细胞悬液参加B组孔中， A组孔中补充少许完整培育基继续培育； B组孔再在温箱中静置15 ～ 20分钟， 吸出尚未贴壁的细胞悬液参加C组孔， B组孔中补充少许完整培育基继续培育。三组孔均在温箱中继续培育， 24小时后，可察看到A组孔主要为FLC， C组孔主要为MC， B组孔FLC和MC混杂。纯化过程可屡次运用。

    1.2.4　细胞系的审定

    1.2.4.1　形态学

    　　倒置显微镜每日察看细胞形态特性、生长特性（“穹隆”构成）， 选择有代表性的生长特性照相。取原代MC、 MC-C3的第19代细胞爬片， 2.5%戊二醛固定后， 扫描电镜常规标本制造,察看。取MC-C3的第19代细胞，消化后， 含血清的培育基终止， 800 r/min，离心10分钟搜集细胞， 2.5% 戊二醛固定后， 透射电镜常规标本制造， 察看。

    1.2.4.2　免疫细胞化学

    　　取原代MC、 MC-C3的第19代细胞爬片， 用1% BSA（牛血清白蛋白）以1 ： 50稀释细胞角蛋白18、 波形蛋白抗体，依照过氧化物酶标志的链酶卵白素染色试剂盒（SABC）的操作指南停止。

    1.2.4.3　SV40 T抗原的检测

    　　应用RT-PCR检测T抗原在MC-C3中的表达， 实验组以第19代MC-C3的cDNA为模板，阴性对照设两个， 分别以无菌水、原代MC的cDNA做模板， 阳性对照以SV40 DNA为模板。

    1.2.4.3.1　细胞总RNA的提取及测定：运用Trizol试剂，操作参照试剂阐明书停止； 提取的总RNA，取1 μl用紫外分光光度计丈量浓度和纯度， -20℃保管。              

    1.2.4.3.2　cDNA第一链合成： 操作参照cDNA第一链合成试剂盒停止， 产物-20℃ 保管。

    1.2.4.3.3　SV40 DNA提取：参照SDS-蛋白酶K法，思索到SV40病毒无包膜，未运用SDS破膜。取5 μl 停止琼脂糖（1.5%）凝胶电泳检测； 其他-20℃保管备用。

    1.2.4.3.4　多聚酶链反响（PCR）： T抗原的引物参见文献［5］（北京赛百胜合成），上游引物（A4239） 5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG- 3’，下游引物（S4496） 5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’； 扩增产物长度为268 bp。扩增条件为94℃， 5 min；（94℃， 1 min； 55℃， 1 min， -0.5 ℃/循环； 72℃，    1 min） × 30；   （94℃， 30S； 40℃， 30S， 72℃， 30S） ×15。扩增体系为50 μl：［Mg2+］ 2 mmol/L、 dNTPs 200 μmol/L、 引物浓度 0.4 μmol/L、 Taq 1U、 模板   5 μl。

    1.2.4.3.5　T抗原mRNA RT-PCR产物测序：取MC-C3 100 μl体系的扩增产物， 用凝胶回收试剂盒（Takara，日本）回收产物， 取2 μl DNA溶液稀释100倍， 测浓度； 余下DNA及上、下游引物各10 μl送大连宝生物公司测序。

    1.2.4.4　IsK蛋白检测

    　　应用RT-PCR检测IsK蛋白在原代MC、第19代MC-C3中的表达，阴性对照以无菌水取代cDNA做模板，阳性对照以心脏cDNA为模板，并以β-actin 为内对照。

    1.2.4.4.1　总RNA提取同1.2.4.3.1

    1.2.4.4.2　第一链cDNA合成同1.2.4.3.2

    1.2.4.4.3　IsK 蛋白mRNA引物参见文献［6］（上海生工合成）。上游引物（23-42）： 5’-CTG TTC TGC CTT TTC TGG CC-3’，下游引物（390-373）： 5’-TGA CAG TGG CTT CAG TTC-3’； 扩增产物长度为368 bp， 逾越了大鼠IsK通道mRNA的三个不同外显子。β-actin的引物参照文献［7］，上游引物（2158-2178）： 5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC-3’， 下游引物（2845-2865）： 5’-TTG ATC TTC ATG GTG CTA GGA-3’； 扩增产物长度为  687 bp。

    　　扩增条件为94℃，10min；（94℃， 1 min； 52℃， 1 min； 72℃，1 min） × 35 循环； 72℃， 10 min。扩增体系为50 μl：［Mg2+］ 2 mmol/L、 dNTPs 200 μmol/L、 引物浓度 0.5 μmol/L、 Taq 1U、 模板2 μl。

    　　PCR产物5 μl，1.5% 琼脂糖凝胶电泳， 80 mV，半小时后在凝胶察看仪中察看，并在凝胶剖析成像系统中照相， 打印。

    1.2.4.5　MC-C3增殖状态及DNA含量检测

    1.2.4.5.1　细胞计数［2］

    　　取MC-C3 第9、 15、 19代细胞，接种至24孔板。每天计数3孔： 消化、 终止、 离心搜集细胞、PBS重悬， 稀释， 计数板计数， 按公式：

    　　细胞数/毫升原液数 = （4大格细胞总数/4） × 10 000 × 稀释倍数

    　　算出细胞数目。计数5-7天， 作生长曲线图。

    1.2.4.5.2　流式细胞术　以大鼠肝细胞为正常对照， 取第19代MC-C3为实验对象，办法参见文献［2］。

    1.2.4.6　软琼脂培育实验 

    　　肝癌细胞株HepG2为阳性对照，办法参见　　文献［2］。

    1.2.4.7　裸鼠致瘤实验

    　　取第19代MC-C3细胞，无血清培育基制成细胞悬液，浓度为1 × 107个/ ml，每只裸鼠皮下注射0.2 ml。肝癌细胞株HepG2为阳性对照（2只）， 无血清培育基为阴性对照（1只）， 实验组（3只）。在实验动物学部的无菌间培育、 察看一月。

    1.2.4.8　MC系的保管［2］

    　　取生长状态良好、 不同世代的MC，消化、 终止、 离心（1 000 r/min， 5 min），用冻存液0.5 ～ 1 ml重悬细胞，细胞密度5 × 106个/ ml，参加冻存管。经4℃， 0.5h； -20℃， 2h； -70℃， 过夜，入液氮保管。

    ２　结　果

    2.1　细胞系的初步树立

    　　原代MC经选择性消化和差别贴壁纯化，接种至24孔板。参加不同滴度的SV40培育。反复若干次后， A（10-3）、 B （10-4）、 C1（10-3）、 C2（10-4）、C3（10-5）中细胞增殖才能明显加强， 镜下察看可见MC呈局灶性生长， 未察看到杂细胞的生长。将这5孔细胞扩展培育后， A、 B、 C1、 C2四孔来源的MC早期（ ＜ 第10代 ）冻存； C3来源的细胞用于继续培育、 审定， 现已培育5月余， 传至二十多代， 指数增生期为2 ～ 4天， 每4 ～ 5天传代一次， 传代比为1 ： 2 ～ 3。 MC-C3根本保存了多角形外观（图1）， 但是， 细胞体积增大，有时可见成堆生长的多核细胞；长满培育器皿后， 仍具有dome构成才能（图2）。必需指出的是， 在传代初期，倾向于较大致积细胞的增长，随着培育时间的延长，多为正常体积细胞的生长，但是整个培育器皿中仍存在明显的“不平均”。本实验未察看到明显的增殖才能降落期 ——“危机期（crisis stage）”。

    2.2　细胞系的审定

    　　MC-C3第19代细胞的扫描电镜示细胞外表有较多小泡样突起，透射电镜可见细胞突起丰厚及细胞间衔接， 单核， 呈圆形并可见分叶，胞内内质网丰厚， 可见空泡样变性的线粒体（图3、 4）。MC-C3中细胞角蛋白18和波形蛋白的表达都为阳性，可见胞质呈现棕黄色，核呈蓝色； 阴性对照仅见蓝色的核（图5、 6）。

    　　SV40病毒DNA的PCR产物为一条单一的带，略大于250 bp，与目的条带大小（268 bp）相符。MC-C3的RT-PCR产物与SV40病毒扩增的产物大小分歧， 测序结果与Genebank（NC_001669）分歧。阴性对照组未见任何条带（图7、 8）。

    　　IsK的RT-PCR扩增结果：心脏组织提取的RNA扩增出一条单一的带，位于300 ～ 400 bp之间，与目的条带大小（368 bp）相符。原代MC、 MC-C3的RT-PCR产物与心脏RNA扩增的产物大小分歧。 内对照β-actin的大小为687 bp， 阴性对照未见任何产物（图9）。

    　　MC-C3系的生长增殖状况如图10所示：埋伏期为48 h， 尔后倍增持续24 ～ 36 h，指数增生期持续2 ～ 4 d。生长至6 ～ 7 d 时， 根本长满24孔板的孔底，培育液中可见漂浮的死细胞， 阐明此时细胞的增殖才能曾经遭到一定的抑止。

    　　流式细胞仪检测结果如图11、 12所示， 标明MC-C3细胞团结活动明显强于正常肝细胞， 为正常二倍体。

    　　软琼脂培育2周后， 察看见HepG2有较多伪足伸出， 贴附在软琼脂上，但增殖不明显。而MC-C3的细胞依然坚持圆形、 不贴附的状态。

    　　裸鼠皮下接种肝癌细胞株HepG2一月，见肿瘤生长（2/2）；实验组接种MC-C3，均无肿瘤生长（3/3）；注射无血清培育基组，无肿瘤生长（1/1）。

    ３　讨　论

    3.1　MC原代培育办法及纯化

    3.1.1　边缘细胞的培育办法

    　　细胞的原代培育大致有两种办法：消化法和组织块法。Rarey等初次用消化法树立了牛耳蜗的原代培育体系，四只牛颞骨共获得湿重5 ～ 10 mg的SV， 消化时间持续1.5 ～ 3 h。由于消化法对培育细胞的生机和成分都有影响，最后取得的细胞克隆只要50% 是MC［8］。在运用大鼠做实验动物之前， 本文作者曾选用豚鼠这一耳科更常用的实验动物， 并应用正色豚鼠外侧壁组织的色素标志， 可在1 ～ 2 h内完成培育取材的全过程；以培育次数记， MC长出率可达80%以上； 按组织块记数， MC长出率为20 -30%。由于豚鼠停止MC培育胜利率不高，兼之思索到形态学和免疫细胞化学审定MC之缺乏（见下文），遂改用基因序列已公开的大鼠作为实验动物。由于前期取材办法、实验条件已探索成熟， 从大鼠取材时，以培育次数记，MC长出率为100%； 按组织块记数， MC长出率为80 - 90%。本实验采取的组织块法具有实验动物易得、 培育准备时间短、胜利率较高的优点。文献报道的组织块法中实验动物的选取规范不一［4， 9， 10］： 以体重、 出生天数或仅仅是安康与否为规范。 依据本实验结果， 以出生天数作为大鼠的入选规范远比以体重为规范好，也与文献所指出的动物年龄越小，培育细胞越易存活这一观念相符［2］。

    3.1.2　边缘细胞的纯化

    　　据文献报道［9，10］， 单纯血管纹培育与含血管纹和螺旋韧带的外侧壁组织培育相比，两者产生的结果大致相同 —— MC长出的同时，皆有FLC不同水平的混杂， 但随着MC生长时间的延长， FLC会自动逐步消逝； 但本实验很少察看到FLC自动消逝的现象，反而是FLC的快速生长抑止了MC的生长。本实验运用鄂征引见的选择性消化法和差速贴壁法停止MC的纯化， 但是消化法会降低MC的活性，因而， 除消化法外，本实验还应用如下办法以补偿消化法之缺乏：（1）低血清培育法 —— MC长出后运用低血清的生长因子培育基可促进MC增殖，抑止FLC生长； （2）重复植块法 —— 消化去除FLC时，消化时间控制不好， 组织块也被消化脱壁，用吸管将组织块吸入24孔板的一个孔中， 参加生长因子培育基二次贴壁，长出细胞多为MC。总之，去除混杂的FLC、纯化MC， 应依据培育细胞的实践状况停止选择、组合。MC的纯化是原代培育面临的最大问题，这也是树立MC永生细胞系的缘由。不同滴度的SV40与纯化后的MC共培育， 历时3个月， 原代培育近30次。35 mm皿内纯化的MC以8 ～ 9 × 104个计，则转化胜利的比率仅为十万分之一，与文献报道的诱导发作率相近。实践上，MC-C3是全部实验中独一被转化并传代的一孔（24孔板/30板）细胞。

    3.2　MC永生细胞系的审定

    　　运用SV40 树立细胞系后，审定的关键问题有两方面： 一方面请求该细胞具有持续的增殖才能，即T抗原在细胞系中稳定表达；另一方面又要其形态、 根本生理功用等表型坚持不变。

    3.2.1　T抗原的检测以及恶性增殖的扫除

    　　检测T抗原在细胞系中表达常用的办法有免疫细胞化学法、 斑点杂交法，检测的对象分别是T抗原蛋白和编码T抗原的DNA分子。 综合思索实验本钱、 操作难易水平以及实验目的（检测T抗原的表达）， 本实验选取T抗原mRNA作为检测对象，并将RT-PCR产物测序， 在转录程度证明了SV40 T抗原曾经较稳定地表达于该细胞系中。由于SV40病毒DNA的特性，编码T抗原的DNA序列也就是T抗原mRNA的互补序列，据此本实验直接提取病毒DNA作为RT-PCR的阳性对照。本实验参照文献引物及扩增条件［5］， 未能扩增出目的条带， 使得本实验结果（MC永生细胞系的树立）的精确性很长时间存疑，后选用降落PCR（Touch Down PCR， TD-PCR）胜利扩增出目的片段， 经测序证明是SV40 T抗原的一局部片段。

    　　恶性肿瘤细胞能无限增殖，但同时具有以下特性［2］： 非锚着依赖性、裸鼠致瘤性以及非整倍体染色体。本研讨选用不同世代MC-C3， 经过软琼脂培育、 裸鼠致瘤实验、流式细胞技术等手腕根本扫除了MC-C3恶性转化的可能。

    3.2.2　形态学、免疫细胞化学及IsK的检测

    　　MC-C3根本坚持了多角形外观，细胞角蛋白、波形蛋白表达双阳性，透射电镜可见细胞突起之间的衔接等等，这些都阐明边缘细胞的根本特征未发作大的变化。Dome构成、细胞外表丰厚的小泡样构造， 证明MC-C3保存了细胞间的严密衔接， 依然具有分泌性上皮的特性［4］。 但是， 这与在体MC仅表达角蛋白存在差别；况且形态学也仅能大致区别上皮样细胞和成纤维样细胞， 在耳蜗组织中，还存在其它上皮样细胞。为了确证MC-C3的来源，本实验引入了特征性IsK蛋白mRNA的检测。

    　　IsK蛋白，也称KCNE1、 minK，与KCNQ1（KvLQT1）一同组成迟缓激活延迟整流的K+ 通道，属于调理亚单位， 散布于肾脏、 心脏、 颌下腺［4］等。在耳蜗中， IsK 定位于血管纹MC的顶侧膜，是该膜上主要的离子通道，也是内淋巴中K+ 的重要来源，可作为MC的共同标志物［4］。RT-PCR结果标明，MC-C3表达IsK， 这再一次阐明MC-C3为来源于血管纹的边缘细胞。培育过程中同时也留意到， 与原代MC比拟， MC-C3的细胞体积增大，细胞之间的衔接变得较为疏松。这些变化其实也是在倒置显微镜下察看SV40 T抗原有无整合、细胞系能否已初步树立的一个指标。本实验的一系列审定工作证明这些变化并没有影响MC特有表型［4， 8-10］的表达；但是必需认识到目前所研讨的MC的特有表型的局限性，因此本实验不能得出MC-C3系和原代MC完整一样的结论。

    　　但是， 在细胞刚开端转化，增殖力加强以及随后的传代过程中，都能看到散在、 成丛散布、 体积增大的多核细胞。当传代比例过大时（1 ： 4以上），细胞体积增大更为明显。这种形态学的变化，是一种“老化”现象［2］。揣测细胞转化早期， SV40未能转化一局部， 以至是大局部的细胞。这局部细胞由于没有永生化的才能， 逐步退化， 体积增大， 空泡样变，在传代过程中被淘汰。而在较晚的细胞世代中， “老化”的呈现可能与细胞生长的密度依赖性有关 ——正常细胞的生长具有密度依赖性： 细胞密渡过低时， 互相之间的一些“联络”无法或较难停止， 因此不能正常生长， 较早呈现退化； 另一个方面，密渡过高时呈现接触抑止的现象，但是肿瘤细胞没有接触抑止现象。在研讨MC-C3的生长曲线时， 我们曾经察看到了这种接触抑止现象。检测锚着依赖性的软琼脂培育以及更直接的裸鼠致瘤实验也都扫除了MC-C3具有肿瘤特征的可能。原代培育时， 运用了含20% FCS的完整培育基；纯化后与病毒共培育，阅历了无血清、 2%NBCS、 10% NBCS（各3天）的培育基成分变化，刚转化的MC依然用20% FCS的培育基增殖， 稳定传代至第10代， 降低FCS浓度， 分别为：15%、 10%、 5%， 察看MC-C3的生长状况。发现5% FCS时，细胞生长明显遭到抑止、退化明显。

    　　细胞系树立后，细胞的生长可能再度减慢以至停滞。早期（4 ～ 6代）的停滞， 与病毒基因未能整合有关；稍晚期（10 ～ 15代或更晚）进入“危机期”，多数细胞中止增殖，仅有少数细胞还能继续增长。危机期后的细胞分化差、原有细胞的特有表型大多消逝。可能的机制有： （1）整合的病毒基因发作了改动，特别是重组而惹起的缺失。（2） 整合基因的切除和丧失 —— 在大T功用存在的条件下，带有DNA复制起始点的整合的病毒基因能够反复地停止部分复制，复制序列间的重组能够惹起病毒全基因的切除，招致病毒复制，惹起细胞死亡；假如对转化必需的序列完整被切除，则惹起细胞逆转。（3） 细胞基因的改动 —— 控制整合病毒基因表达的细胞基因发作改动，或者抗癌基因被激活，这些都可使转化细胞发作逆转。MC-C3系在目前的21代中，未见危机期的呈现，直到第19代，仍可见T抗原表达。这间接阐明T抗原已稳定整合于MC基因组中。

    　　流式细胞术检测结果提示，MC-C3第19代细胞群体中， 合成、 团结的细胞比例（M3+M4）大大多于重生大鼠正常体细胞群， 阐明MC-C3的增殖才能明显强于正常体细胞。而这种增殖才能的加强是SV40大T抗原整合、表达的结果。另一方面，流式细胞仪剖析中也未见MC-C3中呈现异常的DNA群体，即细胞系未呈现瘤性特征。但也应留意到，MC-C3中凋亡、坏死的细胞比例明显多于体细胞，这可能与T抗本来身的致凋亡作用有关［3］。

    　　总之，MC-C3具有密度依赖性、锚着依赖性和血清依赖性，无非整倍体的异常DNA群、无裸鼠致瘤性，是一个永生化的、具有MC正常表型的细胞系。MC-C3细胞系的胜利树立，可提供大量来源分歧、性状相近的资料用于分子生物学、电生理等方面的研讨，为进一步说明MC的功用、内淋巴产生的机制打下了根底。

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