宫颈癌Hela细胞在Co-60照射后细胞增殖动力学改变

【摘要】  目的 讨论放射对宫颈癌Hela细胞系再增殖的影响，为宫颈癌能否有必要实行十分规分割放疗提供一定的理论根底。办法 在不同剂量的放射作用下，以台盼蓝染色细胞计数法剖析Hela在映照后不同时间点的潜在倍增时间的变化；以克隆构成实验检测其同期克隆源性细胞存活比率，并将两者分离剖析。结果 （1）Hela细胞在映照后确实呈现Tpot的缩短。（2）在0～8Gy剂量范围内，单次映照剂量越大，其映照后的细胞的Tpot就越短（P<0.01）。（3）映照后细胞的Tpot变化与残存克隆源性细胞的加速再增殖的才能成正相关（r=0.8918）。结论 （1）Hela细胞在映照后会呈现加速增殖，且加速增值的水平可能与剂量有关。（2）放射后Hela细胞的加速再增殖可能与其本身调理有关。

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【关键词】  Hela；肿瘤细胞加速增殖；辐射性效应

     Dynamic change of the auxesis of cervix carcinoma Hela after Co-60 radiotherapy

    LIU Yan，HUANG Wei，LI li，et al.Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

    ［Abstract］  Objective  To explore the effect of radiotherapy on the auxesis of Hela cell in cervix carcinoma to offer the theory elements to identify whether or not the cervix carcinoma would be treated by radiotherapy with non-routine segmentation.Methods  After radiotherapy with different doses,the Hela cells changes of potential doubling time by cytometry with trypanblau coloration were analysed,and the livability of clonogenic cell at the same time was detected by clone,and the two former were combined to aralyse the changes.Results  （1）Tpot shortening was observed in Hela cell after radiotherapy.（2）The more the dose per time,the shorter Tpot of postradiative cell,within 0～8 Gy.（3）Tpot change of postradiative cell is correlative positively to the function of accelerating the reproductive ability of remaining clonogenic cell （r=0.8918）.Conclusion  （1）Hela cell will be accelarated reproduction after radiotherapy,whose degree is probably correlative to the dose.（2）The reproductive speedup of postradiative Hela cell relates to the self-regulation.

    ［Key words］  hela；carcinoma cell;reproduction

    放射治疗的成败取决于它的辐射性生物学效应。当前放射生物学家在对一些肿瘤细胞，特别是头颈部肿瘤细胞的研讨中证明［1，2］，在常规分割放射治疗过程中，残存的肿瘤干细胞会呈现加速再增殖，而这种加速增殖是招致肿瘤放射治疗失败的重要缘由之一［3］。宫颈癌是严重要挟女性身心安康的恶性肿瘤，放疗是中晚期宫颈癌的主要治疗方式，目前也获得一些效果，但是仍有50%以上的宫颈癌放疗后会呈现复发，因而寻觅到更好的放疗计划就显得至关重要［4］。目前检测细胞放射后能否呈现加速增殖的直接指标就是检测其克隆源性细胞的增殖才能，能够间接经过肿瘤细胞潜在性倍增时间（potential doubling time，Tpot）的变化来肯定［5］。

    1  资料与办法

    1.1  细胞培育  人宫颈癌Hela细胞珠由中科院上海细胞生物研讨所提供，我院实验室传代培育。运用RPMI-1640培育液（美国GIBCO公司），其中参加100 μ/ml青霉素和100 μ/ml链霉素，同时参加20%小牛血清（杭州四季青公司），置37 ℃、5%CO2培育箱内。

    1.2  细胞生长曲线和Tpot的测定  在六孔板中培育细胞，每孔参加指数生长期Hela细胞1×104，每三孔为设为一组，每个映照剂量共6组（即6天）。每日取一组搜集原培育液和消化后冲洗液，离心弃上清，沉淀用PBS（0.01 M，pH 7.4）洗濯一次后，再用0.5～1 ml PBS液停止悬浮，台盼蓝染色2 min后运用细胞计数板和相差显微镜停止细胞计数，不被染色的细胞作为活细胞，染蓝的细胞作为死细胞。细胞总数=活细胞+死细胞；活细胞比率=活细胞/细胞总数。潜在倍增时间（Tpot）计算办法：Tpot=Tc×（1-φ）［6］。其中φ为细胞丧失因子，φ=1-活细胞比率；Tc为细胞倍增时间（即培育的细胞总数增加一倍所需时间），Tc=ln2×Δt/ln（N2/N1）；Δt为两次细胞计数的时间距离（单位小时或天）；N1、N2分别为前、后两次细胞计数时活细胞的数量；ln（2）=0.693。在此计算中思索了死细胞要素，即细胞丧失要素。以此计算出活细胞比率，并进一步推算出Tpot。

    1.3  克隆构成率（cloning forming efficiency）的检测  采用平板克隆构成实验，将处于指数生长期的Hela细胞接种于小号培育瓶中（用记号笔将瓶底均匀分为9格，一格设为一个计数范围），接种密度为500个/瓶，细胞被平均打散散布于瓶中。每两瓶设为一个剂量组（共10瓶），映照后每天在倒置显微镜下察看计数细胞的克隆构成状况，察看范围为每个小瓶中心十字形的5个小格，即每个映照剂量计数10个小格。单细胞增殖生成大于50个细胞的细胞团称为一个克隆细胞株。统计数据计算细胞克隆构成率。克隆构成率=实验组的克隆构成数/对照组的克隆构成率。

    1.4  放射关于细胞潜在倍增时间的影响  我们采用实验组细胞潜在倍增时间与对照组细胞的潜在倍增时间的比来停止剖析比拟；而Tpot与放射后Hela克隆源性细胞再增殖的关系：对“不同映照剂量组Tpot/对照组Tpot的比值”与“不同映照剂量下克隆细胞生存率”停止直线相关剖析。

    1.5  放射办法  放射处置采用钴-60远间隔治疗机（Canada THERATRONICS）。于室温空气中映照，源靶距80 cm，剂量率108～111 cGy/min，选用5个剂量点，即对照组0 Gy，实验组2、4、6、8 Gy单次映照。

    1.6  统计学办法  本实验中统计学处置采用方差剖析、团体t、直线相关剖析等。一切实验均反复3次，以SPSS 13.0软件停止统计。

    2  结果

    2.1  Hela潜在倍增时间的测定  经过以上计算办法我们最终得出指数生长期未映照的Hela细胞Tpot约为21.48 h。其中Tc为23.35，而整个生长过程中对照组的活细胞比率为（0.92±0.05）（n=6）。

    2.2  放射对细胞增殖动力学的影响  随着放射剂量增大，除2 Gy组在6天内与对照组相比统计学上尚无差别（P>0.05），其他组Hela细胞Tpot程停止性缩短（P<0.01）。其中8 Gy组由于后续时间细胞简直全部死亡，因而只测到3天的值，见图1。

      2.3  放射后克隆源性细胞增殖变化  放射后，Hela细胞的克隆构成率随即减少。经过对不同放射剂量下Hela细胞存活比率和其Tpot的相关剖析，得出这段时间内Hela细胞存活比率的减少和Tpot的减小亲密相关（r=0.8922），见图2。

      3  讨论

    随着放射生物学的停顿，越来越多的细胞、动物实验和临床材料标明，一些肿瘤细胞在放射后会呈现加速再增殖，而这又常常是许多肿瘤常规分割放疗失败的主要缘由之一［7，8］。因而理解肿瘤细胞增殖动力学的变化，关于改良肿瘤放疗计划具有重要的指导意义。有关细胞增殖动力学的指标目前也比拟多，诸如细胞S期持续时间（Ts）、S期细胞比例（SPF）、DNA倍体、Tpot、克隆细胞构成率等，其中以潜在倍增时间、细胞克隆构成率的意义最得到大家的认可。从上述的实验结果我们得知，宫颈癌Hela细胞系在放射后呈现Tpot缩短，这也提示了Hela在放射后有细胞增殖动力学的改动。

    据目前的研讨证明不同的肿瘤细胞其潜在倍增时间互相差别很大［9］。而肿瘤细胞群体的倍增才能普通与其克隆源性细胞的再生才能亲密相关。从此实验可知宫颈癌细胞株在映照后的加速增殖才能与映照剂量有关。映照剂量越大，肿瘤的Tpot就越小，克隆细胞增殖一倍的时间就越短，细胞增殖就越快。除2Gy映照组在所测时间按内Tpot的改动没有明显的统计学意义（P>0.05），其他剂量均有明显的统计学意义（P<0.01），思索2Gy组的结果可能是丈量时间较短所致。因而在宫颈癌的放射治疗中寻觅更适宜的放疗计划有可能会进一步控制宫颈癌的复发。

    Tpot和克隆细胞生成率的相关剖析标明放射剂量惹起的Hela细胞存活比率的减少与Tpot的缩短呈亲密相关（r=0.8922）。这提示放射后肿瘤的加速再增殖可能是细胞群自身代偿调理所致。这可能有两方面的缘由：（1）放射后毁坏的肿瘤细胞可能会产生或释放某种物质，与其四周的克隆源性细胞发作系列反响，增强了残存细胞的增殖才能。（2）放射后肿瘤细胞大量死亡，残存细胞的生长空间增大，可能减少了细胞间的接触抑止作用。当然除了肿瘤细胞自身本身调理外，其他要素如细胞营养情况、细胞丧失和补充要素不可疏忽。

【参考文献】
  1 陈显钊，唐启信.加速超分割放疗鼻咽癌前瞻性研讨.中国癌症杂志，1999，9:66-68.

2 Fuk K，Pajaka TF，Trotti A，et al.A radiation therapy oncology group（RTOG） phase Ⅲ randomized study to compare hyperfractionation and two variants of accelerated fractionation to standard fractionation radiotherapy for head and neck squamous cell carcinoma:first report of RTOG 9003.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2000，48:7216.

3 易俊林，高黎，黄晓东，等.鼻咽癌放射治疗的失败形式.中华放射肿瘤学杂志，2004，13:145-148.

4 Arakawa K，Shikama N，Sasaki S，et al.Impact of treatment extending to 60 Gy on the outcome of radiotherapy for nasopharyngeal carcinoma.Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi，2003，63:41-46.

5 Ritter MA，Fowler JF，Kim Y，et al.Single biopsy，tumor kinetic analysis:a comparison of methods and an exiension to shorter sampling intervals.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1992，23:811.

6 Nias AHW.Clinical Radiobiology,2nd ed.New York：Churchill Livingstone，1988，36.

7 Trott KR.The mechanisms of acceleration of repopulation in squamousepithelia during daily irradiation.Acta Oncol，1999，38:153-157.

8 Ritter MA.Determination of tumor kinetics:strategies for the delivery of radiotherapy and chemotherapy.Curr Opin Oncol，1999，11:177-182.

9 Lee AW，Sze WM，Yan TK，et al.Retrospective analysis on treating nasopharyngeal carcinoma with accelerated fractionation （6 fractions per weeks） in comparison with conventional fractionation （ 5 fractions per week）:report on 3 year tumor control and normal tissue toxicity.Radio other Oncol，2001，58:121-130.