局部应用维生素C对脂肪细胞凋亡的影响

【摘要】  目的 察看部分应用维生素C对脂肪细胞凋亡的影响。办法 将72只大鼠按部分注射维生素C浓度的不同(006%、012%、024%)随机分为A、B、C 三个实验组，每个实验组按时间的不同(7d、21d、35d)又细分3个亚组,每个亚组8只大鼠。同时在大鼠两侧腹股沟脂肪垫随机选择一侧作为实验侧，另一侧为对照侧。在注射7d、21d、35d后切取组织标本，采用TUNEL免疫组化法显现组织切片中的脂肪细胞凋亡数目。结果 B和C组实验侧的脂肪细胞的凋亡数目均较对照侧增加（P<005），A组实验侧的脂肪细胞的凋亡数与对照侧比拟差别无显著性（P>005）。B和C组实验侧的脂肪细胞的凋亡数目均随着作用时间的延长有增加趋向（P<005）；且C组实验侧较B组实验侧相应作用时间点增加（P<005）。结论 在大鼠部分脂肪组织注射含012%和024%维生素C的试剂有诱发脂肪细胞的凋亡作用。并且上述作用有明显的浓度依赖性和时间依赖性。而部分注射含006%维生素C的试剂对脂肪细胞的凋亡无明显影响。

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【关键词】  维生素C；部分注射；脂肪细胞；凋亡

The effect of local injection with Vitamin C to adipocytes apoptosis

    GAO Yan, WEI Qiang, CHEN Shi-hai, et alThe First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021，China

    【Abstract】  Objective  To observe the effect of injection with Vitamin C to adipocytes apoptosis Methods  72 Sprague-Dawley rats were randomly divided into A, B and C groups (006%, 012% and 024%) by concentration of Vitamin C Each group was randomly divided into three subgroups by inject time 7d, 21d and 35d with eight rats in each subgroup Two sides inguinal fat pad of Sprague-Dawley rats were randomly divided into the experimental and control side On the 7th, 21st and 35th days, specimens were taken from each rat Adipocyte apoptosis was measured by TUNEL method Results  In B and C groups, the amount of adipocyte apoptosis was more in the experimental side than that in the control side (P<005), but there was no significant difference in the amount of adipocyte apoptosis between the experimental side and control side in A group (P>005) In B and C groups, with the injection continuing, the amount of adipocyte apoptosis increased gradually in the control side (P<005), and that of C group was more than that of B group (P<005) Conclusions  Local injection with experimental solution containing 012% and 024% vitamin C in adipose tissue can promote adipocyte apoptosis Meanwhile, the effect is obvious correlative with concentration and time But injection with the experimental solution containing 006% vitamin C doesn\'t have significant impact on adipocyte apoptosis

    【Key words】  Vitamin C; local injection; adipocyte; apoptosis

    软组织形态异常的修复不断是整形外科研讨的重点之一。软组织中脂肪组织占大局部。其形态大小是动态变化的，主要取决于所含有的脂肪细胞的数目和成熟脂肪细胞的体积改动，此变化过程受各种体内外要素的影响。过去人们把研讨主要放在脂肪细胞的增殖和分化上，而对脂肪细胞凋亡的研讨不多，自从1994年Prins等［1］发现脂肪细胞凋亡现象后，经过研讨促进脂肪细胞凋亡的要素，减少脂肪细胞的数目，进而到达减少脂肪组织的目的成为一个新的研讨方向。

    有研讨发现维生素C在体外实验中可促进脂肪细胞凋亡的现象。本文经过在大鼠腹股沟脂肪垫注射含不同浓度的维生素C，察看不同浓度维生素C对脂肪组织中的脂肪细胞凋亡的影响，讨论维生素C对脂肪细胞数目调理作用及其机理，以期为软组织的修复与重建提供新的治疗手腕或有益的启示。

    1  资料与办法

    11  实验动物  安康成年SD大鼠72只，12月龄左右，体重（300±30）g，雄性，纯系，由广西医科大学动物实验中心提供。

    12  试剂和仪器  凋亡试剂盒购于北京中山生物技术有限公司、Leica Q500MC显微图像剖析仪(DMR+Q550,德国)。

    13  实验办法

    131  动物分组  72只SD大鼠将随机分红含006%维生素C实验组（A组）、含012%维生素C实验组（B组）、含024%维生素C实验组（C组），其中各组又依据注射后不同时间（7d、21d、35d）分为3个亚组，每亚组8只。每只大鼠随机选择一侧腹股沟为实验侧，另一侧为对照侧。饲养室温度 18℃～22℃，相对湿度60%～75%，人工混合饲料喂养。

    132  注射药物  常规皮肤碘尔康消毒，随机选择在一侧腹股沟为实验侧，另一侧为对照侧。于腹股沟对称实验区域(以腹股沟为中线，长35cm，宽15cm区域内) 部分平均注射4ml的实验试剂。

    1321  实验侧  在实验区域注射含一定浓度的维生素C的试剂。

    1322  对照侧  在对应区域注射不含维生素C的等体积试剂。

    133  取材  在注射药物后7d、21d、35d时，用2%的戊巴比妥钠（02ml/100g）腹腔注射麻醉，术区备皮，碘尔康消毒术区，在SD大鼠一侧以腹股沟为轴线中间取1cm×1cm大小的标本，标本的切取深度包括皮肤全层及皮下脂肪深达肌膜层。

    134  免疫组化染色  标本经10%福尔马林溶液固定、包埋、切片后应用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标志（Terminal deoxynucleotidyl   transferase-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL）法检测脂肪细胞的凋亡状况。同时设立阳性对照及阴性对照。

    135  脂肪细胞凋亡数测定  凋亡脂肪细胞判别和计量：TUNEL阳性细胞为单个散在散布，细胞呈典型的凋亡形态，四周无炎症反响，阳性染色呈红色。其中设立经过DNA酶处置的切片为阳性对照片，PBS替代TUNEL反响混合物为阴性对照片。将切片置于400倍显微镜下察看其病理表现，应用病理图像剖析仪计数凋亡脂肪细胞数量，每张切片随机取8个视野，每个视野面积3354392μm2 ，取其计数结果的均匀值作为该切片的脂肪细胞凋亡数。

    136  统计学剖析  实验所得数据以x±s表示，用配对t检验比拟组内差别，用方差剖析比拟组间差别。P<005作为差别具有统计学意义。

    2  结果

    21  动物的普通情况  一切大鼠在实验过程中均无脱失、死亡。于麻醉后约2～4h清醒，开端活动，自在进食、进水。喂养期间动物的活动好，食欲可，体重较稳定。

    22  脂肪细胞的凋亡数目计数  如表1和图1～5所示，B、C组实验侧的脂肪细胞的凋亡数目分别均较对照侧增加（P<005）；A组实验侧的脂肪细胞的凋亡数与对照侧比拟差别无显著性（P>005）；B、C组实验侧脂肪细胞的凋亡数目均随着作用时间的延长有增加趋向（P<005）；且同一作用时间点C组脂肪细胞的凋亡数较B组增加（P<005）。表1  注射药物后各组脂肪细胞的凋亡数的组内比拟★P<005相同浓度下不同时间与前一时间点比拟▲P<005相同时间下不同浓度与前一浓度比拟

　　3  讨论

    细胞凋亡（Apoptosis）是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡方式。细胞凋亡和增殖分化一样，是一个受多基因调控的过程，从凋亡的启动到凋亡细胞被吞噬均是基因调理的结果，同时这些基因活动也会遭到外界和内部各种要素的影响。有研讨显现维生素C具有促进细胞凋亡和抗细胞凋亡的双重作用，其促进凋亡和抗凋亡的作用在很大水平上是依赖于其量的几和所作用的细胞类型，其作用机制尚未定论［2，3］。Bagchi［4］ 等研讨以为维生素C作为抗氧化剂，其维护细胞DNA免受损伤的作用是经过调理基因Bcl-2、p53的表达而完成的。Reddy 和Qi ［5，6］等研讨以为维生素C能够经过不同途径促进肿瘤细胞死亡：维生素C下调转录因子AP-1，稳定p53，上调Bax基因，惹起p53及其靶基因Bax积聚从而使宫颈癌细胞系Hela细胞的细胞周期阻滞，惹起细胞凋亡。进入血浆中的抗坏血酸被氧化成脱氢抗坏血酸盐，进入细胞内，经过胞内的氧化复原系统复原，同时惹起氧化复原应激反响，使细胞内谷胱苷肽（GSH）降落，脂质过氧化增加，从而使细胞呈现凋亡。在哺乳动物细胞内，NO 作为一种细胞内生物信使或细胞毒性效应分子介导细胞凋亡,依其浓度和细胞内氧化复原状态启动细胞凋亡或细胞生存信号。维生素C能够经过维生素C-NO合酶及NO-细胞DNA途径调理细胞凋亡。我们的实验结果显现注射含中、高浓度的维生素C的试剂有促进脂肪细胞凋亡的作用，低浓度的维生素C的试剂对脂肪细胞凋亡的作用不明显，维生素C促进脂肪细胞凋亡的作用是呈浓度依赖性。林亚秋等［7］用维生素C对大鼠脂肪细胞凋亡的影响提示高浓度维生素C (100μmol/L)单独作用和与肿瘤坏死因子同时作用都能够显著进步脂肪细胞的凋亡率,而低中浓度维生素C (25～50μmol/L)作用不明显。本实验结果与林亚秋等在细胞程度实验结果局部相契合。同时实验发现脂肪组织切片中不只仅是脂肪细胞，血管内皮细胞、腺体细胞和纤维细胞同等时发作也有不同水平的凋亡现象。这阐明维生素C促进多种组织细胞的凋亡,但是关于各种组织细胞凋亡作用的强度能否分歧，尚需求进一步的研讨。本实验结果提示012%和024%浓度的维生素C可诱导脂肪细胞发作凋亡，能够减少脂肪细胞数目，并且作用与维生素C的浓度和作用时间成正相关。从而为部分脂肪组织堆积提供新的治疗手腕或有益的启示。

【参考文献】
  1 Prins JB, Walker NI, Winterford CM,et alApoptosis of human adipocytes in vitro Biochem Biophys Res Commun,1994,201：500-507

2 Harreus U,Baumeister P,Zieger SThe influence of high doses of vitamin C and zinc on oxidative DNA damageAnticancer research,2005,25：3197-3201

3 Verrax J,Bollen S,Delvaux MNew Insights about the Potential Application of the Association of Vitamins C (Sodium Ascorbate) and K3 (Menadione) as Auxiliary Therapy in Cancer Treatment Medicinal Chemistry Reviews,2005,4：277-282

4 Bagchi M,Kuszynski CA,Balmoori J,et alProtective efects of antioxidants against smokeless tobacco-induced oxidative stress andmodulation of Bcl-2 and p53 genes in human oral keratinocytesFree Radic Res,200l,35：181-194

5 Reddy VG,Khanna N,Singh NVitamin C augments chemotherapeutic response of cervical carcinoma HeLa cells by stabilizing p53Biochem Biophys Res Commun,200l,282：409-415

6 Qi CE,Michael GKPharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells:Action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues Murali CProceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102：13604-13609

7 林亚秋,卢建雄,陈国柱，等维生素C对TNF-α诱导的原代培育大鼠脂肪细胞凋亡的影响细胞生物学杂志,2005, 27：469-473