川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC7901/ADR的杀伤作用
【摘要】 目的 察看川芎嗪（TMP）结合氟尿嘧啶（5Fu）对胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR细胞的体外杀伤作用。办法 采用MTT法察看TMP结合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用，光镜下察看并采用流式细胞仪（FCM）测定各药物组细胞周期的散布。结果 5Fu对SGC7901/ADR细胞的半数抑止率（IC50）为13.001mg/L，与300mg/L TMP结合后，使其的IC50降至1.542mg/L，逆转倍数是8.43倍，与对照组相比差别具有统计学意义（P<0.01）。光镜下可见5Fu+TMP(终浓度300mg/L)组较5Fu组癌细胞皱缩变小变圆，呈现凋亡改动。FCM剖析：TMP结合5Fu与对照组相比将细胞阻滞在DNA合成前期和静息期G0/G1期（P<0.05）。结论 TMP与5Fu结合对胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR有较强的杀伤作用，为当前胃癌治疗提供了新思绪。
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【关键词】 胃癌；多药耐药性；SGC7901/ADR细胞；5Fu；川芎嗪
Lethal Effect of Combination of Tetramethylpyrazine and Fluorouracil in Multidrug Resistance of Gastric Carcinoma Cell Lines SGC7901/ADR
YANG Ye，HOU Peizhen，ZHANG Juan
The Emergency Department of First Affiliated Hospital，BaoTou Medical College，BaoTou 014010，China
Corresponding Author：HOU Peizhen，Email：houpeizhen@126.comAbstract：Objective To investigate the lethal effect of combination of TMP and 5Fu in the multidrug resistance of Gastric Carcinoma Cell Lines SGC7901/ADR. Methods Gastric carcinoma cell lines SGC7901 and the multidrug resistance cell lines SGC7901/ADR were considered as target cells, MTT assay was used to investigate the lethal effect of combination of TMP and 5Fu in vitro,which was observed by Light microscope. Flow cytometer(FCM) was employed to investigate the cell cycles. Results The half inhibition ratio（IC50）of 5Fu against SGC7901/ADR was 13.001 mg/L, which was reduced to 1.542mg/L by 300mg/L TMP,The reversal index was 8.43（P<0.01）.Malignant cell volume and morphous which exposed to 5Fu+TMP became smaller and strinked rounder by Light microscope. FCM revealed that with the effect of 5Fu+TMP,cell cycle was blocked at presynthetic phase and ambiguous phaseG0/G1 phase and The cells enter the period of DNA synthesis were reduced,inhibition mitosis of SGC7901/ADR（P<0.05）. Conclusion Combination of 5Fu and TMP has stronger lethal effect against the multidrugs resistance Cell Lines SGC7901/ADR in Gastric Carcinoma,which may provid a new therapeusis against Gastric Carcinoma.
Key words：Gastric Carcinoma；MDR；SGC7901/ADR；5Fu；TMP
胃癌多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是其化疗失败的主要缘由之一[1]。目前，处理MDR主要办法是经过增加细胞内药物浓度而逆转MDR，但多数逆转剂的毒反作用限制了它们的临床应用。本实验察看低毒、价廉的新型钙通道阻滞剂[2]川芎嗪（TMP）结合氟尿嘧啶（5Fu）对胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR的杀伤作用，为胃癌MDR的治疗提供新办法。
1 资料与办法
1.1 细胞系
人胃癌细胞株SGC7901细胞、耐阿霉素药细胞株 SGC7901/ADR细胞，均由第四军医大学西京医院消化研讨所惠赠。
1.2 药物、试剂及主要仪器
TMP（北京永康药业有限公司产品），5Fu（南通精髓制药有限公司产品），阿霉素（ADM）（汕头经济特区明治医药有限公司产品），RPMI1640（美国GIBCO公司产品），重生小牛血清（杭州四季青生物研讨所产品），MTT、DMSO、胰蛋白酶（美国sigma公司产品），流式细胞仪试剂盒（Exalpa公司产品），倒置显微镜（重庆光学仪器厂产品），酶标仪（美国Biotek公司产品），流式细胞仪（美国BD公司产品）。
1.3 办法
1.3.1 细胞培育 将SGC7901细胞置于10%重生小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培育液中。SGC7901/ADR细胞置于含1.0μg/ml ADM的上述培育液中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培育。SGC7901/ADR细胞实验两周前培育于不含ADM的培育液中。
1.3.2 TMP的非细胞毒性剂量 采用MTT法，取对数生长期的SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞，以5×104/ml接种于96孔细胞培育板上，培育24h。实验孔参加不同浓度的TMP(100、200、300、400、500mg/L)。每浓度设5个复孔，培育48h，参加20μl（5g/L）MTT，4h后参加DMSO150μl，摇床摇匀，以酶标仪490nm波长测定各孔吸光度A值。计算不同药物浓度下细胞的存活率SR[3]（SR=实验组A值/对照组A值×100%）。当细胞存活率SR≥95%[4]时，肯定为本实验的非细胞毒性剂量。
1.3.3 TMP结合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用 办法同上，在SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞中参加①不同浓度5Fu(1×101～1×105μg/L)，②不同浓度5Fu(1×101～1×105μg/L)和非细胞毒性剂量的TMP。计算不同药物浓度下细胞的SR、半数抑止浓度IC50、相对耐药性RF[5] (RF=耐药细胞株IC50/胃癌细胞株IC50)及逆转倍数RI(RI=单独用药IC50/结合逆转剂后IC50)。
1.3.4 FCM剖析细胞周期 搜集经过不同浓度药物处置的SGC7901/ADR细胞，PBS洗濯后，70%冷乙醇固定过夜，离心去乙醇，参加1%RNA酶溶液及碘化丙啶（PI）染液，黑暗避光37℃水浴20min，经特制的尼纶网滤器过滤（冰上操作）于检测管内，上流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，材料用CELLQUEST软件停止剖析。
1.4 统计学办法
采用SPSS11.5统计软件包，停止回归剖析及方差剖析。
2 结果
2.1 TMP的非细胞毒性剂量
TMP在300mg/L浓度以下时，SGC7901/ADR细胞的存活率在95%以上，且相同剂量TMP对敏感细胞无明显毒性作用。故TMP在300mg/L浓度以下为非细胞毒性剂量，见表1。表1 TMP在不同浓度下对肿瘤细胞存活率的影响
2.2 TMP结合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用
SGC7901/ADR细胞对5Fu具有耐药性，相对耐药性为97.49。100～300mg/L TMP对其耐药性有逆转作用且呈剂量依赖关系（R=0.972，P=0.000）。300mg/L TMP能显著增加SGC7901/ADR细胞对5Fu的敏理性，使其相对耐药性降至12.89，逆转倍数为8.43倍。300mg/L TMP结合5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用最强(P<0.01），见表2。光镜下可见300mg/L TMP增强了5Fu对SGC7901/ADR细胞的杀伤作用，癌细胞皱缩变小变圆，细胞呈现凋亡改动，见图1。表2 TMP对SGC7901/ADR细胞耐药性的逆转作用
2.3 细胞周期剖析
FCM剖析证明TMP（终浓度300mg/L）与5Fu结合应用后，使SGC7901/ADR细胞周期阻滞在DNA合成前期和静息期（G0/G1期）的细胞百分比明显高于5Fu组，进入DNA合成期（S期）、DNA合成后期和有丝团结期（G2/M期）细胞百分比明显低于对照组（P<0.05），从而抑止癌细胞DNA的合成和有丝团结，诱导细胞凋亡，见表3。表3 TMP对肿瘤细胞周期的影响
3 讨论
肿瘤产生多药耐药性（MDR）的主要机制是P糖蛋白（P glycoprotin，Pgp）及多药耐药性相关蛋白（multidrug resistence associated protein，MRP）的过表达[6]，惹起药物外流及细胞内药物积存减少。本研讨证明：SGC7901/ADR细胞对5Fu具有耐药性，相对耐药性为97.49。
TMP为中药川芎的主要有效成分，属酰胺类生物碱。近年来发现，TMP可经过多种途径对肿瘤起到治疗和辅助治疗的作用。其钙通道阻滞活性，可局部纠正小鼠腹水癌对阿霉素的抗药性[7]。100～320mg/L的非细胞毒浓度范围内，能增加HL60/VCR细胞对多种化疗药物的敏理性[8]。本实验结果显现， TMP与5Fu配伍没有发作任何药物颜色的改动或沉淀构成，100～300mg/L均可进步SGC7901/ADR细胞对5Fu的敏理性，对5Fu耐药性的逆转作用呈剂量依赖关系，其中以300mg/L TMP作用最强（P<0.01），这可能与TMP的Ca2+拮抗作用有关,大剂量的TMP更能有效降低细胞膜电荷，间接影响Pgp功用[9]，从而进步耐药细胞内5Fu的药物浓度而发挥药理作用。FCM证明两药结合使细胞周期阻滞在G0/G1期，有效抑止癌细胞DNA的合成和有丝团结，诱导其凋亡（P<0.05）。5Fu 结合TMP详细作用机制，能否经过降低多药耐药基因MDR1的高表达，影响Pgp功用，从而进步细胞内5Fu的浓度加强化疗效果，此结果有待进一步深化研讨。
【参考文献】
［1］ Chipponi J.Huguier M.Pezel D.et al.Randomized trial of adjuvant chemotherapy after curative for gastric cancer[J].Am J Surg，2004，187(3):440445.
[2] 王玉良，巴彦坤. 川芎嗪对心血管组织的药理和电生理作用一种新的“钙离子拮抗剂” [J].中西医分离杂志，1985,5(5):291.
[3]Britton RA,Green JA,Warenius HM.Cellular glutathione(GSH) and glutathione Stransferase (GST) activity in human ovarian tumor biopsies following exposure to alkylating agents[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,24(3):527531.
[4] Vassetzky TS，Alghisi GC，Gasser SM，et al.DNA topoisomerase Ⅱ mutation and resistance to antitumor drugs[J].Bioessays,1995,17(9):767774.
[5] 杨琳，朱兆华.维拉帕米对多药耐药胃癌细胞耐药逆转作用的研讨[J].中华消化杂志,2002,22(2):112113.
[6] Choi JII,Lim IIY,Joo IIJ,et al.Expression of multidrug resistanceassociated protein Ⅰ,Pglyeoprotein,and thymidylate synthase in gastric cancer patients treated with 5fluorouracil and doxorubicinbased adjuvant chemotherapy after curative resection[J].Br J Cancer，2002,86(10):15781585.
[7] 胡艳平，刘建，王庆端，等.川芎嗪和维拉帕米纠正阿霉素对小鼠腹水癌的抗药性[J].药学学报，1993，28（1）：7578.
[8] 梁蓉，杨平地，陈协平，等.川芎嗪对白血病细胞HL60/VCR细胞多药耐药的逆转及其机制的研讨[J].中华血液学杂志，1993，20（6）：323324.
[9] 杨牡丹,李亮成.胃癌多药耐药基因研讨停顿[J].山西临床医药杂志,2001,10(3):163166