慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞和T淋巴细胞亚群的研究

　【摘要】 目的 观察外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)百分比和T淋巴细胞亚群在慢性乙型肝炎(CHB)患者中的特点。方法 采集CHB患者15例和健康对照20例的外周血单个核细胞(PBMC)标本，应用三色流式分析法对PBMC中CD4+CD25+ Tregs占CD4+百分比及外周血中的T淋巴细胞亚群进行分析。结果 分别比较CD4+CD25highTregs和CD4+CD25+CD127low/-Tregs占CD4+T细胞百分比，两组表型的Tregs在CHB组均高于正常对照组〔(4.25%±3.22%vs1.57%±0.64%)，(4.39%±2.03%vs1.86%±0.84%)〕(P<0.01)。CHB组外周血中的CD4+T淋巴细胞亚群的百分比(32.28%±6.26%)较正常对照组(39.39%±10.73%)下降，统计学有差别(P<0.05)。外周血中CD8+及CD4+/CD8+比值在两组间变化无统计学差异。结论 CHB患者CD4+CD25high和CD4+CD25+CD127low/-Tregs升高，外周血中的CD4+T淋巴细胞百分比下降。  

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　　【关键词】 肝炎，乙型，慢性;CD4+CD25+调节性T细胞;T淋巴细胞亚群

　　慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者机体免疫功能紊乱，病毒在体内不能彻底清除，组织损伤迁延不愈。部分患者发展为肝硬化和肝癌，是老年人常见的死因之一。T淋巴细胞是机体抗感染免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞，是细胞免疫的主要组成部分。CD4+CD25+调节性T细胞是具有抑制活性的调节性T细胞(Tregs)〔1〕，可能在其发病机制中起关键作用。我们采用流式细胞技术，分别选取了CD4+CD25highTregs，CD4+CD25+CD127low/-Tregs作为本研究中CD4+CD25+Tregs的表面标记，对CHB病人的外周血中的CD4+CD25+ Tregs进行鉴定和分析，并且对慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中的T淋巴细胞亚群变化进行了相关研究。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 病例均选自本院2006年3月至2006年11月临床确诊CHB患者，共15例，诊断符合2005年中华医学会肝病学分会、感染病学分会《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准。入选患者在入组前6个月内未经任何抗病毒及免疫抑制剂治疗，并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。另选取20例健康体检人群为对照组，无肝炎病史，乙型肝炎标志物测定均阴性，血清转氨酶和黄疸指数均正常。

　　1.2 主要试剂和仪器 采用美国贝克曼流式细胞仪，三色标记单克隆抗CD25，CD127，CD4 分别与FITC、PE、PerCP5荧光素结合，另选三色标记单克隆抗CD4、CD8、CD3分别与FITC、PE、PerCP荧光素结合，均购自美国CALTAG公司。

　　1.3 流式细胞仪检测CD4+CD25+Tregs和T淋巴细胞亚群 取新鲜采集的枸橼酸钠抗凝血1 ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),取大约1×105个细胞加入5 μl下列三组荧光标记抗体：CD25-FITC，CD4-PerCP5，CD127-PE，震荡器混匀，25℃避光孵育30 min，PBS洗涤1次,离心后弃上清，加入少量PBS制成单细胞悬液。分别选择CD4+CD25high(荧光强度>102)和CD4+CD25+CD127low/-T细胞群作为Treg的表型鉴定,分析其占CD4+T细胞百分比。另取40 μl新鲜枸橼酸钠抗凝血，加入3 μl下列3组荧光标记抗体：CD3- PerCP5，CD4- FITC，CD8-PE，震荡器混匀，25℃避光孵育30 min，加入溶血素，PBS洗涤1次,离心后弃上清，加入少量PBS制成单细胞悬液。上机使用CellQuest软件收获细胞并进行分析。

　　1.4 统计学处理 数据以x±s表示，用SPSS10.0软件进行两组间t检验。

　　2 结果

　　2.1 外周血Treg水平 两组Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比在CHB患者组均明显高于正常对照组 (P<0.01，表1)。

　　表1 两组外周血中CD4+CD25+Tregs/CD4+T淋巴细胞的百分比及T淋巴细胞亚群的比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.01;2)P<0.05

　　2.2 T淋巴细胞亚群的变化 CHB组外周血中的CD4+T淋巴细胞亚群的百分比较正常对照组下降(P<0.05)。外周血中CD8+及CD4+/CD8+比值无显著差异(P>0.05，表1)。

　　3 讨论

　　CHB患者体内抗病毒反应较弱,细胞免疫机制起着重要作用。T淋巴细胞在细胞免疫中起核心调节作用,其中CD4+及CD8+T细胞是两类主要亚群，对清除病毒感染有重要作用。因此检测外周血T淋巴细胞的水平可以较好地反映患者的免疫功能状态。CD4+CD25+Tregs的免疫抑制作用已经在多种自身免疫性疾病和感染性疾病中得到证实〔2，3〕。多项研究数据显示这种抑制作用是通过细胞-细胞接触实现的，并且呈剂量依赖性〔4〕。目前关于CHB感染者体内外周血CD4+CD25+Tregs比例的研究较少,且研究结果各不相同〔5～7〕，Stoop〔5〕研究小组检测结果表明慢性感染者外周血CD4+CD25+Tregs频率较正常增高。Franzese等〔6〕检测后发现，CHB组和健康对照组无明显差异。上述研究亦未结合外周血T淋巴细胞水平的测定。

　　在以往的研究中，Foxp3被认为是CD4+CD25+Tregs的特异性标志〔8〕，但其属于胞内蛋白，检测时需细胞破膜处理，易导致检测结果不稳定。最新研究表明证实CD4+CD25+Tregs表面抗原CD127低表达与Foxp3表达有高度一致性〔9〕，故我们同时检测了CD4+CD25high和CD4+CD25low/-两种不同表型鉴定的Tregs,结果更为可靠。结果表明CHB患者外周血中的CD4+CD25highTregs和CD4+CD25low/-Tregs占CD4+T细胞的百分比和正常组相比较均明显升高，统计学有显著差异(P<0.01)。对CHB患者的T淋巴细胞亚群分析后发现CD4+T细胞的比例在CHB组较正常组降低，统计学上有显著差异(P<0.05)。上述研究结果说明CHB病人体内的CD4+CD25+Tregs水平异常,可能是其导致乙型肝炎病人免疫耐受原因之一。慢性HBV感染的患者CD4+T细胞在外周血中比例下降,提示CHB患者细胞免疫功能低下。考虑可能的原因是CHB患者体内CD4+CD25+Tregs对抗原特异性的CD4+T细胞增殖有抑制作用〔10〕，且这种抑制作用是呈剂量依赖性的〔1〕。故增高的CD4+CD25+Tregs可能导致CD4+T细胞的下降，我们的研究未发现CD8+T淋巴细胞和CD4+/CD8+的比值在两组间有统计学差异，可能是因我们研究的治疗时间较短，病例数少，故差异不显著。

　　CHB患者体内异常的CD4+CD25+Tregs水平和T淋巴细胞亚群，可能是其免疫功能紊乱的原因，但关于这方面的研究，尚需大样本的证实，同时对于CD4+CD25+CD127low/-Tregs需更多的功能性的研究来证明。

　　【参考文献】

　　1 Sakaguchi S.Regulatory T cells:key controllers of immunologic self-tolerance〔J〕.Cell,2000;101(5):455-8.

　　2 Cureil TJ,Coukos G,Zou L,et al.Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival〔J〕.Nat Med,2004;10(9)：942-9.

　　3 Cabrera R,Tu Z,Xu Y,et al.An immunomodulatory role for CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in hepatitis C virus infection〔J〕. Hepatology,2004;40:1062-71.

　　4 Nakamura K,Kitani A,Strober W.Cell contact-dependent immunosuppression by CD4+CD25+regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta〔J〕.Exp Med,2001;194 (5):629-44.

　　5 Stoop JN,van der Molen RG,Baan CC,et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection〔J〕.Hepatology,2005;41：771-8.

　　6 Franzese O,Kennedy PT,Gehring AJ,et al.Modulation of the CD8+T cell response by CD4+ CD25+ regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection〔J〕.Virology,2005;79:3322-8.

　　7 福军亮,徐东平,施 明,等.乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞型与功能分析〔J〕.中华内科杂志,2006;45(8):642-5.

　　8 Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3〔J〕.Science,2003;299:1057-61.

　　9 Liu WH,Putnam AL,Xu-Yu Z,et al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ Treg cells〔J〕. Exp Med,2006;203:1701-11.