甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因启动子甲基化研究
【摘要】 目的 讨论甲状腺乳头状癌组织中促甲状腺激素受体基因 (Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR)基因启动子区5’端CpG岛甲基化改动的特性与临床特征的关系。办法 采用甲基化特异性PCR(MSP, methylation-specific PCR)办法检测TSHR基因启动子甲基化状况。结果 (1)22/34例甲状腺乳头状癌组织中检测到TSHR基因启动子甲基化，9/34例甲状腺乳头状癌癌旁组织中检测到TSHR基因启动子甲基化，癌组织中TSHR基因启动子甲基化率显著增高(χ2=10019,P=0002<005);(2)有淋巴结转移的甲状腺乳头状癌组织(15/18例)TSHR基因启动子的甲基化显著高于无淋巴结转移组(7/16例)(χ2=5812,P=0016<005)。结论 TSHR基因启动子异常甲基化是甲状腺乳头状癌开展过程中的分子事情之一，可能影响了甲状腺乳头状癌细胞的摄碘的功用。
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【关键词】 甲状腺乳头状癌;TSHR基因;甲基化特异性PCR
Methylation of TSHR gene promoter in papillary thyroid carcinomas
TANG Jian-dong, LI Xia-lianDepartment of Endocrinology, Zhengzhou Central Hospital, Henan 450007，China
[Abstract] Objective To detect the methylation status of the promoter region of TSHR (Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR) gene in PTC (Papillary Thyroid Carcinomas), the relationship between the aberrant methylation of TSHR gene and clinical manifestation was analyzed Methods Using methylation-specific PCR technique (MSP), specimens form 34 PTC patients (tumor tissues, Adjacent Thyroid Tissures, ATT) to detect methylation of TSHR promoter region Results 22 cases in 34 PTC patients were detected hypermethylation of TSHR gene in promoter region, 9 cases in 34 ATT were detected hypermethylation of TSHR Gene in promoter region, the rate of methylation of TSHR promoter in PTC was higher than that in ATT (χ2=10019,P=0002<005) The rate of methylation with lymph nodes metastasis (15/18) was obviously higher than that without lymph nodes metastasis (7/16, χ2=5812,P=0016<005) Conclusion Methylation of TSHR gene in promoter region is a common molecule event and may play some role in iodide-uptake of human PTC
[Key words] papillary thyroid carcinomas; TSHR gene; methylation-specific PCR (MSP)
甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinomas,PTC )经手术治疗预后相对良好，但是近年来大多数人以为，在甲状腺全切除或次全切以后，应当采用131I去除残留甲状腺组织[1]。放射性碘发挥杀伤肿瘤细胞效应的根底是肿瘤细胞必需具有摄取碘的才能。甲状腺内碘的主动转运是经过甲状腺滤泡细胞基底膜上的钠碘转运体(sodium iodide symporter, NIS)介导[2]。NIS是甲状腺滤泡细胞基底膜上的一种糖蛋白，可被促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)激活[3]。TSH经过与甲状腺滤泡细胞基底膜上的促甲状腺激素受体(TSHR)分离刺激甲状腺汇集碘而全面调理甲状腺功用，TSH对NIS的影响主要表如今：(1)TSH可上调NIS mRNA和蛋白的表达[4～6]。(2)TSH可调理NIS的亚细胞散布[7～9]。研讨发现，大多分化型甲状腺癌的摄碘率的降低与NIS蛋白表达位点的改动有关，也就是NIS蛋白常常表达在胞内而非表达在质膜上。质膜NIS的位点和表达，不但对甲状腺主动性转运碘起作用，而且对甲状腺癌的放射性131I治疗也起着至关重要的作用[7～9]。笔者应用甲基化特异性PCR(methylation-specific pCR，MSP)技术分别检测了甲状腺乳头状癌组织及其癌旁组织中TSHR基因启动子区甲基化的异常，并与患者的临床材料相联络，讨论TSHR 基因启动子区甲基化在甲状腺乳头状癌开展过程中的作用和意义，希望能为甲状腺乳头状癌的早期诊断和放射性碘治疗提供有价值的实验材料。
1 资料与办法
11 实验资料
111 对象材料 取自2005年11月—2006年8月郑州大学第一隶属医院甲状腺外科及郑州市中心医院普通外科手术切除的34例甲状腺乳头状癌及癌旁组织(距癌组织≥08cm)。参照美国癌肿协会制定的规范[10]停止临床分期，Ⅰ期25例，Ⅱ期3例，Ⅲ期6例，Ⅳ期0例。其中男5例，女29例，年龄20～79岁，均匀41岁，有淋巴结转移的18例，无淋巴结转移的16例。术前均未放疗、化疗，术后一切标本均经病理检查证明。标本离体后2h内放置液氮罐中保管。
112 主要试剂 CpGenomeTM DNA Modification Kit为 Chemicon公司产品(S7820); SssI 甲基化酶、HS TaqDNA聚合酶为大连宝生物工程技术有限公司产品(DR007A);引物设计依据TSHR基因序列(Genebank ID: AC010072)并参照Zhao等[11]由大连宝生物工程技术有限公司合成，甲基化引物[F(m)]序列：正义链为5’-TGTAGAGTTGAGAATGAGGTGATTTC-3’, 反义链为5’-CAACTACAACAAATCCGCCG-3’, PCR产物扩增长度为88bp; 非甲基化引物[F(u)]序列：正义链为5’-TGTAGAGTTGAGAATGAGGTGATTTT-3’, 反义链为5’-CACCAACTACAACAAATCCACCA-3’, PCR产物扩增长度为91bp。
12 办法
121 组织DNA的提取 采用常规的蛋白酶K消化、酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀法，TE溶解后用紫外分光光度计定量。A260/A280均介于17～20之间，-20℃保管备用。
122 DNA的亚硫酸氢盐修饰 取1μg DNA 按修饰试剂盒阐明书操作步骤停止修饰，修饰好的DNA，-20℃保管备用(≤2月)。
123 MSP 采用Hot Start PCR反响体系为25μl, 包括10XBuffer 25μl、dNTPs 2μl、上游引物(20μM)03μl、下游引物(20μM)03μl、模板4μl、HS TaqDNA聚合酶025μl、加水至25μl，混匀后，稍离心。反响条件为：95℃预变性5min，94℃45s，56℃60s，72℃60s，40个循环，最后1个循环72℃延伸7min，PCR产物经2%含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统下察看并照相。
13 统计学办法 实验结果采用SPSS100统计软件包停止统计剖析。应用χ2 检验和Fisher’s准确概率法， P<005为差别有显著性。
2 结果
21 甲状腺乳头状癌组织与癌旁组织中TSHR基因甲基化情况 34例甲状腺乳头状癌组织中有22例检测到TSHR基因甲基化，甲基化率为647%,(其中完整甲基化12例，局部甲基化为10例)，34例甲状腺乳头状癌癌旁组织中有9例检测到TSHR基因甲基化，甲基化率为265%(其中完整甲基化4例，局部甲基化为5例)，癌组织中TSHR基因启动子甲基化显著增高(χ2=10019,P=0002<005)。有淋巴结转移的甲状腺乳头状癌组织15/18例TSHR基因启动子发作甲基化(其中完整甲基化8例，局部甲基化为7例)显著高于无淋巴结转移组(16例有7例发作甲基化，其中完整甲基化4例，局部甲基化为3例)(χ2=5812,P=0016<005)(见表1)。
22 TSHR基因甲基化与甲状腺乳头状癌患者临床特征的关系 TSHR基因甲基化与年龄、性别、临床分期均无相关性(P>005)，可能与病例数少有关(见表1)。
23 PCR产物电泳图结果剖析 见图1。
表1 TSHR基因甲基化与甲状腺乳头状癌患者临床特征之间的关系注：(1) b为 Fisher’s exact test; (2) M为完整甲基化,MU为局部甲基化，UM为未发作甲基化
A 1为甲基化阳性对照;2为甲基化阴性对照;3、4、5、6为癌组织;7、8为癌旁组织;1、3、5、7扩增甲基化引物;2、4、6、8扩增非甲基化引物。Marker : 100bp DNA Ladder;7、8提示半甲基化，2、4、6提示非甲基化
B 1为甲基化阳性对照;2为甲基化阴性对照;3、4为癌组织;5、6、7、8为癌旁组织;1、3、5、7扩增甲基化引物;2、4、6、8扩增非甲基化引物;Marker:100bp DNA Ladder;7、8提示半甲基化;6提示非甲基化图1 甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因的MSP扩增情况
3 讨论
TSHR是甲状腺细胞的一种特异性蛋白质，主要散布于甲状腺滤泡上皮细胞膜上。人的TSHR基因位于染色体14q31,长度约为60Kb[12],含有10个外显子，9个内含子，TSHR蛋白含有764个氨基酸，分为膜外区、跨膜区和膜内区三个局部，膜外区有418个氨基酸，是TSH辨认和分离的部位。TSHR的主要功用是与TSH分离，经过刺激甲状腺汇集碘全面调理甲状腺功用。这种作用主要是经过信号转导途径TSH-TSHR-cAMP-PKA通路来完成的，TSH和TSHR分离后激活腺苷酸环化酶(cAMP)，使胞内的cAMP浓度疾速上升激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),PKA激活核内的特异性转录因子或使之发作磷酸化，全面调理甲状腺功用[13]。另外，TSH对NIS影响主要表如今：(1)TSH可上调NIS mRNA和蛋白的表达[4～6];(2)TSH可调理NIS的亚细胞散布[7～9]。研讨发现，大多分化型甲状腺癌的摄碘率的降低与NIS蛋白表达位点的改动有关，也就是NIS蛋白常常表达在胞内而非表达在质膜上。质膜NIS的位点和表达，不但对甲状腺主动性转运碘起作用，而且对甲状腺癌的放射性131I治疗也起着至关重要的作用[7～9]。
本研讨用MSP同时检测癌及其癌旁组织目的是为了便于同一个体比拟，防止个体差别。结果发现甲状腺乳头状癌及癌旁组织中TSHR基因甲基化率分别为647%、265%，启动子区CpG岛的异常甲基化可能会招致TSHR基因功用的失活或降落，因此TSHR基因甲基化可能会对人甲状腺乳头状癌的开展有一定的促进作用。Zhao等[11]报道39例甲状腺乳头状癌细胞株中有23例TSHR基因启动子区CpG岛发作甲基化, 甲基化发作率为59%，本实验结果与之类似。由此可见，TSHR基因启动子区CpG岛发作的甲基化是TSHR基因功用的失活或降落,由于TSH对甲状腺细胞功用和NIS有重要影响，TSHR基因启动子区CpG岛发作的甲基化可能是招致甲状腺细胞摄碘率降落的重要缘由之一。
在局部癌及癌旁组织中，既有甲基化特异引物的扩增，同时也有非甲基化特异引物的扩增, 局部甲基化也属于甲基化。可能的缘由[14]有:(1)癌组织、癌旁组织中混杂了炎性、正常或无异常甲基化的细胞。(2)可能是肿瘤细胞中两个等位基因自身为半甲基化状态，PCR扩增后有较高表达。(3)癌细胞的甲基化存在异质性，即同一例肿瘤组织中不同的细胞亚群有不同的甲基化状态。Fanx、Inda 等[15]以为CpG 岛的甲基化是一个渐进的过程，也就是说,每一个CpG 岛上存在的胞嘧啶碱基是逐步被甲基化的。Gonzalgo等[16]以为5-CpG 岛甲基化到达一定比率(>60%)时才足以完整关闭基因表达，而低比例的甲基化只能降低基因的转录表达。不论TSHR基因CpG岛是局部甲基化还是完整甲基化，CpG岛的逐步异常的甲基化状态会招致TSHR基因的表达降落，TSHR蛋白的功用也将逐步降落、以至完整消逝，最终影响甲状腺乳头状癌细胞的摄碘功用。
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