电化学治疗对宫颈癌Hela细胞中电压激活性K+电流和K+通道KCNJ16基因表达及细胞增殖的影响
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【关键词】 宫颈癌Hela细胞；电化学治疗；全细胞膜片钳记载；钾离子通道；细胞增殖
Influence of electrochemotherapy on voltage-activated K+ current and cell proliferation in cervical cancer Hela cells
LIU Chan-zhen,TANG Bu-jian,LI li,et al.Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021,China
［Abstract］ Objective To study the inhibition of voltage-activated K+ conductance and cell proliferation by electrochemotherapy in the human cervical cancer Hela cells.Methods Inhibition of voltage-activated K+ current by electrochemotherapy through the whole-cell patch-clamp technique was studied.To observe the expression of gene KCNJ16 influenced by electrochemotherapy through the RT-PCR technique.To observe growth tendency of Hela cell treated by electrochemotherapy through counting live cells and drawing growth curve.Results The whole-cell patch-clamp test showed that around the negative electrode，the Hela cells treated by electrochemotherapy reduced the peak outward K+ current (evoked by a depolarization to +50 mV) from (1.22±0.11) nA(n=10) to (0.96±0.10) nA(n=10).And around the positive electrode，the Hela cells treated by electrochemotherapy reduced the peak outward K+ current (evoked by a depolarization to +50 mV )from (1.22±0.11) to (1.02±0.10) nA(n=10).From the RT-PCR test，we could find that both in negative electrode and in positive electrode，the expression of the gene KCNJ16 of Hela cells after treatment by electrochemotherapy is lower than that of normal Hela cells.And through counting live cells and drawing growth curve，the results showed that after electrochemotherapy，the proliferation of Hela cells was inhibited both in negative electrode and in positive electrode，but the effect of inhibition could be recovered in the case of the existence of Pin，which activates the K+ channels in the cell membrane.Conclusion The voltage-activated K+ channels expressed by Hela cells play an important role in Hela cell proliferation.The electrochemotherapy inhibits the proliferation of the Hela cells by inhibited K+ channel in the cell membrane.
［Key words］ cervical cancer Hela cells;electrochemotherapy，the whole-cell patch-clamp recording;potassium channel;cell proliferation
电化学疗法(electro-chemotherapy，ECT)是近20年开展起来的治疗恶性肿瘤的新技术，是经过施加直流电场于肿瘤组织，使阴极和阳极的组织细胞分别产生不同的pH变化、水电解质的变化、自在基的变化等，从而影响肿瘤组织细胞的生长周期、部分及全身免疫反响等，抑止肿瘤的生长［1］。大量的研讨标明，电化学疗法是一种操作烦琐、疗效好、平安性较佳的肿瘤部分治疗办法。对人体深部和浅表的肿瘤毁坏性强，且毁坏肿瘤的范围能遭到有效控制，在肿瘤的部分治疗中展示出宽广的应用前景，目前已普遍应用于宫颈癌的部分治疗，成为宫颈癌重要的辅助治疗措施。
已有研讨肯定经电化学治疗一定的电量后，阳电极区及阴电极区组织中的离子浓度发作相当大的变化，对人体有显著生理作用的电解质K+、Na+、Cl-、Mg2+均向阴极区组织迁移，而Ca2+、Cu2+则向阳极区组织挪动［2］。但是电化学治疗后离子通道的变化与其对肿瘤的治疗机制的关系依然不明。最近10余年的众多研讨标明，细胞膜上K+通道的活性对细胞增殖起关键作用，本文主要研讨电化学治疗对宫颈癌Hela细胞中电压激活性K+电流的影响，以及对钾通道基因表达的影响，从而剖析电化学的治疗作用机制。
1 资料与办法
1.1 试剂和溶液 RPMI-1640干粉，美国GIBCO公司产品；HEPES、胰蛋白酶、TTX、TEA-CL、Na2ATP均为Sigma公司产品；小牛血清（FBS）为杭州四季青公司产品。其他试剂均为国产剖析纯。膜片钳实验所需细胞浴液成分:NaCl 135 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、CaCl2 1.8 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、TTX 4×10-4 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、NaH2PO4 33 mmol/L。电极液成分:KCl 140 mmol/L、CaCl2 1 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、EGTA 11 mmol/L、Na2ATP 2 mmol/L、HEPES 10 mmol/L。以上两种溶液均用NaOH调pH值到7.2，运用前用0.2 μmol/L的滤膜滤过。TEA-CL被蒸馏水溶解，配制成20 mmol/L，4 ℃下备用［3］。
1.2 细胞培育 本实验所用的Hela细胞来至中国科学院上海生物细胞研讨所细胞库，于37 ℃、5% CO2且湿度恒定的孵育箱中培育。培育基为RPMI-1640，含10%小牛血清。每次全细胞膜片钳实验前，将细胞置于涂有多聚赖氨酸的玻璃平皿中贴壁，24 h后可停止操作。
1.3 全细胞膜片钳记载和剖析 全细胞膜片钳记载在室温下停止(22 ℃～25 ℃)。刺激频率为0.5 Hz，钳制时间为200 ms，坚持电压从-80 mV逐渐去极化到+50 mV，每级10 mV，诱发出外向K+电流［3］。同一细胞完成上述实验后，分别参加20 mmol/L的TEA-CL，反复实验1次，并记载K+电流的变化。实验分3组，未经过电化学治疗的Hela细胞，以及经过（5V，10C）的电化学剂量治疗的阳极及阴极细胞，每个实验组记载的细胞个数为5个，实验反复3次。
1.4 RT-PCR 用Trizol试剂盒提取电化学治疗前后宫颈癌Hela总RNA，紫外分光光度仪测OD260/OD280比值，均大于1.8，阐明所提RNA契合请求；将RNA定量为1 μg/μl，反转录成cDNA引物序列，目的基因引物S：5’ CAG TGA AGG GAG GAT GAC 3’；A：5’ CGA ACT GGT GGT GCT TTT 3’；内参GAPDH基因引物S：5’GAA GGT GAA GGT CGG AGT 3’；A：5’GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 3’，按下列程序停止PCR反响，94 ℃预变性5 min，然后以94 ℃变性1 min、54 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min停止27次循环，最后以72 ℃延伸10 min。取5 μl RT-PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像剖析。以GAPDH基因作为内参照，计算机灰度扫描求积定量，计算目的条带与GAPDH灰度比值。
1.5 活细胞计数法测电化学对宫颈癌细胞生长曲线的影响 将细胞分为5组：正常对照组，电化学治疗后阴极组及阳极组，电化学治疗并用含钾通道开放剂比那地尔的培育液培育的阴极组和阳极组。台盼蓝染色后，倒置显微镜下察看计数晶莹透亮、形态完好细胞。计数细胞计数板四个角方格内细胞总数。按公式：
细胞密度=四角16方格内细胞总数 4×10000计算3孔细胞数取均匀值，以减少误差，并以细胞数为纵轴、时间为横轴做生长曲线图。
1.6 统计学办法 一切实验反复3次，所得数据用统计软件SPSS 13.0处置，以均值±规范差(x±s)表示，成组设计单要素方差剖析两样本均数间两两比拟。
2 结果
2.1 全细胞膜片钳实验检测Hela细胞的K+电流 每一检测细胞均检测出外向K+电流(Ik)。细胞的Ik在200 ms的检测电压过程中不灭活，对溶液中参加TEA-CL敏感。当对照组Ik阶跃电压至+ 50 mV时，被诱发出的Ik为（1.22±0.11）nA，被检测的细胞数为10个细胞;当分别在这些细胞的溶液中参加20 mmol/L的TEA-CL时，Ik即降低到（0.57±0.10）nA，减少了52%(P<0.01），用正常外液灌流该电流后恢复，证明该外向电流为K+电流（见图1）。而经过（5V，10C）电化学治疗后，阴极处细胞+50mV被诱发出的Ik为（0.96±0.10）nA，减少了21%(P<0.05)，I-V曲线下移;阳极处细胞+50 mV被诱发出的Ik为（1.02±0.10）nA，减少了18%(P<0.05)，I-V曲线下移(见图2)，每组所检测的细胞数为10个。
2.2 RT-PCR电泳结果 结果显现，在402Bp和226Bp处可见明晰的扩增条带，分别为电压门控型K+通道KCNJ16以及内参照GAPDH。经凝胶成像系统光密度扫描仪剖析各组标本，计算目的条带与内参照的A比值，发现经电化学治疗阴极和阳极的表达量低于正常组细胞，见表1、图3。表1 RT-PCR电泳结果注：与对照组比拟，*P<0.01，**P<0.05
2.3 电化学治疗对宫颈癌Hela细胞生长曲线的影响 结果提示：经过电化学治疗后阴极及阳极的细胞7天内的生长曲线比未经过治疗的细胞组明显下移，而在电化学治疗后予K+通道开放剂比那地尔的培育液培育的阴极及阳极细胞组，其7天内的生长曲线比电化学治疗后用普通培育液培育的阴极及阳极细胞组有明显上移（见图4）。图4 细胞生长曲线图
3 讨论
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其治疗办法主要为以放疗、化疗为主的综合治疗，而关于不能手术、放疗或化疗无效的患者，电化学治疗可到达临床治愈、止痛、缓解病症、延长生命的治疗效果，成为重要的辅助治疗手腕［2］。电化学治疗是依据Nordemstrom提出的血管—间质闭合电路，应用直流电场脉冲电流，强迫性地改动肿瘤细胞的微环境，从而使肿瘤细胞丧失生存环境而死亡的新疗法［2］。
近年来，由于膜片钳技术的开展，使人们对生物体的电现象和其生命现象有了进一步的理解，构成了许多病因学和病理学方面的新观念，在离子通道与肿瘤关系的研讨中，K+通道是研讨得最多的。众多研讨标明，细胞膜上K+通道活性在细胞的有丝团结中起重要作用［4］。并有K+通道和人体肿瘤细胞增殖关系的研讨证明，K+通道阻滞剂可抑止人的结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤细胞以及神经鞘瘤中Schwann细胞的增殖，并可诱导肝癌细胞的凋亡［5～7］。
本实验以此为根底，分别运用膜片钳技术和RT-PCR技术研讨电化学治疗对宫颈癌Hela细胞K+通道电流功用及其基因表达的影响，分离细胞计数功用实验，剖析电化学治疗对K+通道的影响与其杀瘤机制之间的关系。由此证明了电化学治疗后阴极及阳极的细胞K+通道电流强度削弱，其相关基因表达削弱，所以电化学治疗对Hela细胞K+通道有抑止作用，而参加K+通道开放剂解除这种抑止后，在生长曲线上标明电化学对Hela细胞的杀伤作用也因而削弱。
笔者以为，电化学对宫颈癌Hela细胞的抑止杀伤作用可能会有如下机制：（1）抑止了K+通道，改动了细胞静息电位，改动了细胞根本生理特征；（2）抑止了K+通道，从而抑止了Hela细胞膜上动作电位的产生，改动了细胞膜上最根本的生理特征，使细胞增殖遭到抑止；（3）降低了细胞膜上K+通道相关蛋白的表达水平使细胞增殖遭到抑止［6，8］。
总之，电压门控性钾通道在Hela细胞增殖中起重要作用，电化学治疗能够经过抑止电压门控性K+通道抑止Hela细胞的增殖。
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