真核表达survivin基因对曲古菌素A诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响

【摘要】  目的 讨论survivin基因对曲古菌素A(TSA)诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。办法 （1）将本实验室已构建胜利的survivin正义全长真核表达质粒（pcDNA3.1survivin），经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780，以转染pcDNA3.1空载体的A2780细胞为对照。（2）RTPCR和Western blot办法分别检测survivin mRNA和蛋白质的表达。（3）MTT比色法和流式细胞仪(FACS)分别检测TSA对两组细胞存活率和凋亡率的影响。（4）Western blot检测TSA作用下A2780细胞中survivin蛋白的表达变化。结果 （1）RTPCR和Western blot检测提示转染pcDNA3.1survivin组中survivin mRNA和蛋白质表达明显高于空载体组。（2）MTT比色法和FACS检测提示转染pcDNA3.1survivin组细胞存活率明显高于空载体组,细胞凋亡率明显低于空载体组，差别有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1survivin转染后的A2780细胞对TSA的敏理性明显降低。（3）Western blot检测提示survivin的表达程度随着TSA作用时间的延长而降落。结论 曲古菌素A诱导卵巢癌细胞的凋亡作用可能与survivin基因表达有关。

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【关键词】  survivin基因；卵巢肿瘤; 曲古菌素A; 细胞凋亡

Effect of Eukaryotic Expression of survivin on Apoptosis of Ovarian Cancer Cell Induced by Trichostatin A

    MA Xiaoli，XING Hui，WU Peng，WENG Danhui，LU Yunping，MA Ding

    Department of Obstetrics and Gynecology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

    Corresponding Author：MA Ding，Email：dma@tjh.tjmu.edu.cnAbstract：Objective   To investigate the effect of survivin expression on apoptosis of ovarian cancer cells induced by Trichostatin A(TSA). Methods  （1）A2780 cells were transfected with pcDNA3.1survivin(fulllength survivin cDNA) which has been successfully constructed in our laboratory. A2780 Cells transfected with pcDNA3.1 were cultured as controls.（2）The expression of survivin mRNA and protein was detected by RTPCR and Western blot, respectively. （3）Two cell groups were treated with TSA and analyzed for suvival and apoptotic rate by MTT assay and flow cytometry (FACS). （4）Expression of survivin protein was detected under TSA treatment by Western blot. Results  （1）The level of survivin mRNA and protein in transfected cells transfected with pcDNA3.1survivin was significantly higher than that in control cells detected by RTPCR and Western blot.（2）The viable rate of cells transfected with pcDNA3.1survivin was obviously higher than that of control cells and the apoptotic rate was significantly lower than control detected by MTT assay and FACS, respectively(P<0.05). The sensitivity of A2780 cells transfected with pcDNA3.1survivin to TSA was greatly reduced.（3）The expression of survivin in A2780 cells obviously decreased with TSA incubation time. Conclusion  Apoptosis of ovarian cancer cells induced by TSA may be related to the expression of survivin gene.

    Key words：survivin；Ovarian neoplasms；Trichostatin A；Apoptosis

    卵巢癌在女性生殖器肿瘤中预后最差,极易转移和复发,这与卵巢癌化疗耐药亲密相关。survivin基因是一种细胞凋亡抑止基因,位于17q25,是凋亡抑止蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)中的一员[1]。它表达于胚胎和胎儿组织及绝大多数肿瘤组织，但在成人终末分化组织(胸腺、生殖器除外)无表达[2] 。它参与了恶性肿瘤的发作、开展和凋亡抵御,使其成为值得关注的抗癌治疗靶基因。曲古菌素A( trichostatin A, TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑止剂,经过改动瘤细胞染色体上组蛋白去乙酰化程度,影响多种基因的表达程度,从而诱导细胞周期阻滞和凋亡[3]。本实验将survivin的正义全长真核表达质粒（pcDNA3.1survivin）转染人卵巢癌细胞A2780，讨论survivin基因对曲古菌素A(TSA)诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。

    1  资料和办法

    1.1  资料

    1.1.1  资料和试剂  人卵巢癌细胞株A2780由武汉大学中国典型物种保藏中心提供；小牛血清为杭州四季青生物工程资料有限公司产品;Trizol试剂和培育基RPMI1640购自美国Gbico BRL公司；曲古菌素A购自Sigma公司；survivin兔抗人单克隆抗体购自Santa Cruz公司;四甲基偶氮唑盐(MTT, 5mg/ml, PBS配制)购自Amresco公司;脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen TM公司；survivin正义全长真核表达质粒（pcDNA3.1survivin）为本实验室保管[4]；PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

    1.1.2  主要仪器  酶标仪为美国BioRad2550型;流式细胞仪(FACScan Becton Dickinson)为美国公司产品;Western blot电转仪(Biometra,German)为德国公司产品。

    1.2  办法

    1.2.1  细胞培育  人卵巢癌细胞株A2780培育于含10%新颖小牛血清的RPMI 1640培育基中,置于37℃, 5%CO2, 相对湿度90%的培育箱中培育,细胞呈贴壁生长。

    1.2.2  转染  脂质体LipofectamineTM2000包裹已构建好的pcDNA3.1survivin重组体和pcDNA3.1空载体，将A2780细胞以1×106/ml接种6孔板，待其生长至70%～80%交融时开端转染，转染办法参考Gibco BRL操作手册，所用pcDNA3.1survivin的量为4.0μg/孔，脂质体10μl/孔，孵育6h后终止转染，G418挑选稳定转染pcDNA3.1survivin的A2780细胞（A2780survivin）和稳定转染pcDNA3.1的A2780细胞(A2780Con)。

    1.2.3  RTPCR检测survivin mRNA转录程度的变化  搜集A2780survivin和A2780Con细胞，按Trizol试剂一步法提取细胞总RNA。用MMLV逆转录酶停止逆转录，将mRNA转录为cDNA。内源对照GAPDH基因上、下游引物碱基序列分别为：5′ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG3′和5′TGA TTT TGG AGG GAT CTC GC3′，产物长度为230bp, 循环条件：预变性95℃ 3min，变性94℃ 30s, 退火56℃ 30s, 延伸72℃ 30s, 共32个循环, 最后72℃再延伸10min。survivin基因上、下游引物碱基序列分别为：5′CCG CAT CTC TAC ATT CAA G3′和5′CCA GAG GCC TCA ATC CAT3′，产物长度为370bp，循环条件：预变性94℃ 3min, 变性94℃ 30s, 退火55℃ 1min, 延伸72℃ 1min 30s, 共35个循环, 最后72℃再延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后EB染色, 紫外灯下察看结果，照相, 图像经Uvpgrabit Image软件采集, 计算各条带Asurvivin/AGAPDH的比值,以此作为survivin mRNA的相对表达量。

    1.2.4  Western blot检测survivin蛋白质程度的变化  搜集A2780survivin和A2780Con细胞，裂解并提取蛋白, 采用考马斯亮蓝G250染料法停止蛋白定量。100μg总蛋白停止10%SDSPAGE凝胶电泳, 以蛋白电泳转移仪(Biometra, German)将蛋白转至NC膜上, 脱脂奶室温封锁2h，参加1∶500兔抗人survivin，4℃反响过夜, TBST洗膜, 参加1∶500碱性磷酸酶标志的二抗37℃孵育1h，NBT/BCIP系统显色30min。图像经Uvpgrabit Image软件采集, 计算各条带Asurvivin/Aβactin的比值，以此作为survivin 蛋白的相对表达量。

    1.2.5  TSA敏理性的检测  （1）MTT比色法检测细胞存活率：将A2780survivin和A2780Con细胞分别接种于96孔板中, 调整细胞浓度，每孔接种8 000个细胞。TSA作用48h（浓度梯度250、500、750、1000nM）后, 每孔加MTT(5mg/ml)10μl作用2h, DMSO 200μl作用30min后,酶标仪570nm处测定每孔吸光度(A)值,每个浓度设5个复孔, 计算细胞存活率(%)=各浓度组吸光度值/空白组吸光度值×100%, 并绘制生存曲线。（2）FACS检测细胞凋亡：将两组细胞接种于6孔板中, 用浓度2μM的TSA作用12h、24h后消化、搜集细胞，1 000r/min离心8min，弃上清, 用冰预冷75%乙醇固定, 过夜。离心, 弃上清。PBS洗两遍。调整细胞浓度, 依次参加RNA酶、PI，避光保管30min, 上机检测细胞凋亡。以上实验均反复3次。

    1.2.6  TSA处置后survivin表达测定  A2780细胞接种于6孔板, 待细胞交融度到达约50%～60%时,用2μM TSA分别处置0、6、12、24h, 搜集细胞, 用Western blot法检测survivin蛋白的相对表达量。

    1.3  统计学办法

    实验数据以±s表示, 采用配对t检验，P<0.05为差别有统计学意义，应用SPSS10.0软件包对实验数据停止统计学剖析。

    2  结果

    2.1  A2780survivin组和A2780Con组中survivin表达的比拟

    分别搜集A2780survivin组中的2个细胞克隆（C1，C2）和A2780Con组的1个细胞克隆(C0)。RTPCR结果显现A2780survivin组中survivin mRNA相对表达量明显增高(P<0.05), C0～C2的Asurvivin/AGAPDH比值分别为(0.26±0.04)、(1.85±0.06)和(1.02±0.05)，见图1。Western blot结果显现A2780survivin组中survivin蛋白相对表达量明显增高(P<0.05)，C0～C2的Asurvivin/Aβactin比值分别为(0.26±0.05)、(0.63±0.08)和(0.52±0.11)，见图2。结果标明，A2780survivin组中survivin的表达明显高于A2780Con组。

    2.2  A2780survivin组和A2780Con组的TSA敏理性的比拟

    2.2.1  细胞存活率的比拟  MTT比色法结果显现，A2780survivin细胞和A2780细胞经浓度为250、500、750、1 000nM的TSA作用后，A2780survivin细胞的存活率明显高于A2780Con细胞（P<0.05），见图3。

    2.2.2  细胞凋亡率的比拟  FACS结果显现，A2780survivin细胞和A2780Con细胞经2μM的TSA作用后，A2780survivin细胞凋亡率为（15.78±2.24）%，明显低于A2780Con细胞（36.55±2.86）%（P<0.05）。

    2.3  TSA处置后A2780细胞中survivin表达的变化

    Western blot结果显现TSA处置A2780细胞后survivin的表达逐步降落，0、6、12、24h Asurvivin/Aβactin的比值分别为(0.25±0.10)、(0.22±0.12)、(0.17±0.08)和(0.09±0.01)(P<0.05)，见图4。

    3  讨论

    细胞凋亡的抑止在肿瘤发作开展及耐药构成中具有重要作用。肿瘤细胞可经过增高凋亡阈值,降低凋亡刺激因子诱导的细胞凋亡敏理性,从而招致细胞凋亡耐受的发作[5]。染色质的构造改动是真核细胞基因表达调控的一个重要机制,核小体DNA 序列的完好组装以及染色质序列的高度有序确保了基因转录的正常停止,当核小体组蛋白乙酰化程度发作变化时可影响特定转录因子的活性,从而调理相关基因的转录与表达[6]。正常细胞中组蛋白乙酰基转移酶( histone acetyltransferase, HATs) 和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs) 的活性处于均衡状态，调理组蛋白的乙酰化程度,保证相应基因正常表达。HDAC抑止剂是一类经过抑止HDACs 活性而改动染色质构造在转录程度对基因表达停止调控的化合物。曲古菌素A是一种由抗真菌药物衍生而来的HDACs 活性的强效非竞争性抑止剂,对血液系统肿瘤和本质性肿瘤均有较强的抑止作用[7]。能抑止组蛋白去乙酰化酶,使乙酰化水平增高,重塑染色质为转录活性构造, 影响多种基因的表达程度,从而诱导细胞周期阻滞和凋亡。研讨证明,无论是在体内还是体外, TSA 均能够诱导实体肿瘤细胞生长阻滞、分化和凋亡。

    业已证明,凋亡抑止蛋白能够抑止细胞凋亡。IAPs 家族中的某些成员能够直接经过和细胞凋亡终末效应因子Caspase3、Caspase7前体分离抑止其活性从而抑止细胞凋亡[8]，维护肿瘤细胞免受凋亡损伤。survivin是IAPs家族中分子量最小的成员,是迄今发现的最强凋亡抑止因子。研讨证明,过度表达的survivin可维护细胞免受受体或损伤惹起的凋亡[9]。因而, survivin过表达与肿瘤耐药构成有关,并有可能成为肿瘤治疗的理想分子靶点。

    本研讨中, 我们将survivin的正义全长真核表达质粒（pcDNA3.1survivin）转染人卵巢癌细胞A2780, 上调survivin基因的表达。本实验效应检测结果标明,转染survivin正义全长真核表达质粒后,细胞存活率增高,细胞凋亡率降低，对曲古菌素A敏理性降落,表现出对曲古菌素A的耐受。此外,在曲古菌素A作用下人卵巢癌细胞A2780中survivin基因的表达呈降落趋向, 由此揣测，曲古菌素A诱导的卵巢癌细胞凋亡作用与survivin的表达有关，这与以往报道分歧[10]，survivin能够作为一个新的治疗靶点而被进一步研讨。

【参考文献】
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