端粒酶、P16、RB、PCNA在胰腺癌组织中的表达及意义

【摘要】  目的 讨论端粒酶活性、P16、RB、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在胰腺癌组织中的表达及意义。办法 对39例胰腺癌及11例胰腺良性病变采用PCRTRAP办法检测端粒酶活性，免疫组化SP法定位察看P16、RB、PCNA表达。结果 端粒酶、P16、RB、PCNA标志指数(labeling index,LI)在胰腺癌中表达阳性率分别为92.3%(36/39)、43.6%(17/39)、71.9%(28/39)、(47.8±11.3)%。与胰腺良性病变比拟差别有统计学意义(P<0.05)。端粒酶阳性、P16和RB表达缺失者PCNA LI显著增高(P<0.05)。端粒酶活性与P16表达、P16与RB表达均呈显著负相关(P<0.05)。P16/RB失活组端粒酶阳性率显著高于P16阳性/RB阳性组(P<0.05)。P16表达缺失和PCNA高值组临床病期较晚，更易发作淋巴结转移(P<0.05)。结论 端粒酶激活、P16、RB表达缺失在胰腺癌发作中起重要的调理作用，而且是促进细胞增殖重要要素之一。P16表达缺失与胰腺癌的转移和浸润可能有亲密关系。

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【关键词】  胰腺肿瘤； 端粒酶； P16； RB； PCNA； 基因

     Expressions of Telomerase, P16, RB and PCNA in pancreatic cancer tisseus and their significance  XU Yuanhong, OUYANG Bing, YU Guozhi, GUO Renxuan, GUO Kejian. Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China

    Corresponding author: XU Yuanhong, Email: yuanhongxu@hotmail.com

    【Abstract】  Objective  To investigate expressions of significance of telomerase, P16, RB and PCNA in pancreatic cancer tissues and their significance. Methods  Expressions of P16, RB and PCNA in tissues from 39 cases with pancreatic cancer and 11 benign leisions were observed by means of immunohistochemical method. In the meantime, telomerase activity was investigated by using telomeric repeat amplification protocal (TRAP) assay. Results  The positive expression rate of telomerase, P16, RB, PCNAL1 in pancreatic cancer tissues were 92.3%, 43.6%, 71.9% and (47.8±11.3)%, respectively, with statistica difference compared with benign leisions (P<0.05 or P<0.01). The cases with expression deletion of telomerase activation, P16 and RB showed significanty higher level level PCNA LI （P<0.05）. There found negative correlation between expression of  P16 and that of RB as well as expression of telomerase and that of P16 (P<0.05). The positive rate of telomerase in P16/RB deletion group was significantly higher than that in P16+/RB+ group (P<0.05). The expression deletion of P16 and high level of PCNA were correlated closely with lymph node metastasis (P<0.05). Conclusions  Telomerase activation, expression deletion of P16 and RB genes may be important molecular event in occurrence of pancreatic cancer and is one of vital factors pomoting cell proliferation. The loss expression of P16 is probably correlated closely with infiltration and metastasis of pancreatic cancer.

    【Key words】  Pancreatic cancer;  Telomerase;  P16;  RB;  PCNA;  Gene

    端粒酶、p16、RB是调控肿瘤细胞永生化和癌变的重要基因，与肿瘤细胞增殖失控、转移和浸润关系亲密［1-3］。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作为肿瘤群体增殖动力学参数对研讨肿瘤生物学行为有很高价值［4］。本文应用PCRTRAP和免疫组化染色对胰腺癌的端粒酶、P16、RB、PCNA停止检测，讨论它们在胰腺癌的发作、转移和浸润中的作用及互相关系。

    1  资料与办法

    1.1  资料

    39例胰腺癌(31例导管细胞癌、3例浆液性囊腺癌、3例黏液性囊腺癌、2例胰岛细胞癌)，11例胰腺良性病变(6例胰腺囊腺瘤、1例胰腺腺瘤、4例慢性胰腺炎)，均取自中国医科大学第一临床学院和辽宁省肿瘤医院1998年5月至1999年10月手术切除标本。

    1.2  试剂

    TRAP端粒酶检测试剂盒购自美国Intergen公司；Taq酶购自日本Takara公司；P16、RB多克隆抗体、PCNA单克隆抗体、生物素标志的二抗购自北京中山生物技术有限公司；SP试剂盒购自ZYMED公司。

    1.3  办法

    (1)端粒酶检测：取组织标本50～100 mg用液氮在高压消毒过的研钵中研成粉末，转入2 ml玻璃匀浆器，参加200 μl 1×CHAPS裂解液制成匀浆，冰上孵育30 min，4 ℃以下12 000 r/min离心20 min，取上清液，以液氮速冻后置-80 ℃保管备用。

    PCRTRAP办法检测：25 μl反响体系中DEPC水19.8 μl，10×TRAP缓冲液2.5 μl，50×dNTPs 0.5 μl，TS引物0.5 μl，TRAP混合引物0.5 μl，Taq酶0.2 μl(1 u)，最后参加端粒酶提取液1 μl。TS引物在端粒酶介导下30 ℃延伸30 min，混匀后在热循环仪上停止35个循环的PCR反响，循环条件为：94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min。

    选用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，以250 V电压电泳30 min左右，取下凝胶，经EB染色后，在GDS8000UPV成像仪上察看，保管所得图像。

    结果断定：假如在内对照带以外，呈现其距离6 bp的梯带，则判别为端粒酶阳性；假如只要内对照带，则为端粒酶阴性。

    (2)P16、RB、PCNA表达：免疫组化染色办法SP法：按阐明书严厉操作。

    结果断定：以已知阳性切片作阳性对照，用PBS代一抗作阴性对照。RB、PCNA阳性物质定位于细胞核；P16定位于胞质。PCNA标志指数(labeling index,LI)=阳性细胞数/500(双盲法，记数500个肿瘤细胞，5个高倍视野，取均值)。

    1.4  统计学剖析

    数据采用χ2检验、t检验和Spearman等级相关检验。P<0.05为差别有统计学意义。

    2  结果

    2.1  端粒酶、P16、RB、PCNA在胰腺良、恶性病变中的表达(表1、图1～4)表1  端粒酶、P16、RB在胰腺良、恶性病变中的表达

    2.2  端粒酶、P16、RB表达与PCNA LI的关系(表2)表2  端粒酶、P16、RB与PCNA表达间的关系

    2.3  端粒酶、P16、RB表达间的互相关系

    端粒酶阳性/P16阳性者14例，端粒酶阳性/P16阴性者22例，端粒酶阴性/P16阳性者3例，端粒酶阴性/P16阴性者0例，Spearman相关剖析检验r＝-0.794 3，P<0.05。

    端粒酶阳性/RB阳性者26例，端粒酶阳性/RB阴性者10例，端粒酶阴性/RB阳性者2例，端粒酶阴性/RB阴性者1例，r=-0.543 2，P>0.05。

    P16阳性/RB阳性者6例，P16阳性/RB阴性者11例，P16阴性/RB阳性者22例，P16阴性/RB阴性者0例，r=-0.874 9，P<0.01。

    P16/RB失活组共计33例，32例表达端粒酶阳性，占96.9%；P16阳性/RB阳性组共计6例，1例表达端粒酶阳性，占16.6%，两者比拟差别有统计学意义(P<0.01)。

    2.4  端粒酶、P16、RB、PCNA表达与胰腺癌分化、临床分期和转移的关系(表3)表3  端粒酶、P16、RB、PCNA表达与胰腺癌相关指标的关系

    3  讨论

    1989年Morin等初次在人的癌细胞系中发现端粒酶以来，肿瘤细胞永生化的“端粒端粒酶”假说已被越来越多的研讨成果所证明。以为人体细胞的死亡过程有两种程序控制，即第分歧死期M1期和第二致死期M2期，M1期由P53、P16、RB等正常抑癌基因所产生的蛋白控制，M2期由端粒酶控制［5］。由此可见端粒酶、P16、RB基因表达的蛋白在肿瘤细胞永生化过程中起至关重要的作用。

    胰腺癌的端粒酶活性检测，国内外报道较少［6］。本研讨显现，端粒酶在胰腺癌组织中的表达阳性率显著高于胰腺良性病变，P16、RB基因表达蛋白阳性率显著低于胰腺良性病变，提示端粒酶激活、P16、RB表达蛋白的缺失，在胰腺癌的发作中起重要作用，是良好的肿瘤标志物。PCNA在胰腺癌中表达明显增加，散布呈异质性，提示胰腺癌细胞生长调理失控,DNA合成紊乱，反响出肿瘤增殖细胞群中并非一切细胞均同步增殖。在胰腺癌组织中端粒酶阳性、P16、RB表达缺失，其PCNA表达明显增加。这阐明端粒酶激活、P16、RB表达缺失是促进细胞增殖重要要素之一。

    P16、RB蛋白是一类负性细胞周期的调控蛋白，相关剖析证明P16与RB表达间存在显著负相关性。同时，这一结果也证明了P16、RB基因表达蛋白调控胰腺细胞癌变的机理是一个负反应环路。在此反应环内，P16、RB表达蛋白任何之一表达缺失，都将招致调理环路的中缀，形成细胞的异常增殖，最终招致胰腺癌的发作。

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    调控细胞永生化的端粒酶和P16蛋白在胰腺癌中的表达呈显著的负相关性，提示P16蛋白表达缺失分离端粒酶激活，可能在胰腺癌的发作上起着非常重要作用，与肿瘤发作的端粒端粒酶假说相吻合。Tresnasari等［7］在研讨淋巴瘤构成中提出，P16/RB通路失活或P16表达下调分离端粒酶活性加强是招致淋巴瘤构成的致癌理论。在本研讨中，P16/RB失活组端粒酶表达阳性率显著高于P16阳性/RB阳性组。这阐明P16/RB通路失活和端粒酶激活是原发性胰腺癌发作中的重要组成要素。

    本研讨显现，P16表达缺失的患者临床分期较晚，更易发作淋巴结转移。这提示P16表达缺失，不只在胰腺实体瘤的构成过程中起重要作用，而且对四周脏器的浸润和淋巴结转移可能也起着非常重要的作用。PCNA作为原位检测肿瘤细胞增殖活性的指标，其表达与肿瘤的分化、浸润、转移均有亲密相关性，可作为肿瘤鉴别诊断和预后的参考指标。

【参考文献】
  ［1］ Sampedro Camarena F, Cano Serral G, Sampedro Santalo F. Telomerase and telomere dynamics in ageing and cancer: current status and future directions. Clin Transl Oncol,2007,9(3):145-154.

［2］ Matsuda Y, Ichida T. p16 and p27 are functionally correlated during the progress of hepatocarcinogenesis. Med Mol Morphol,2006,39(4):169-175.

［3］ WikenheiserBrokamp K A. Retinoblastoma regulatory pathway in lung cancer. Curr Mol Med,2006,6(7):783-793.

［4］ 许元鸿，郭仁宣，郭克建，等.增殖细胞核抗原(PCNA)在原发性胆囊癌中的表达及预后意义.中华消化杂志，1998，18(1):10-12.

［5］ Wen V W, Wu K, Baksh S. Telomeredriven karyotypic complexity concurs with p16INK4a inactivation in TP53competent immortal endothelial cells. Cancer Res,2006,66(22):10691-10700.

［6］ 许元鸿，富伟能，郭仁宣.胰腺癌端粒酶活性的研讨.中华消化杂志，2000，20(6)：427-428.

［7］ Tresnasari K, Takakuwa T, Ham M F, et al. Telomere dysfunction and inactivation of the p16(INK4a)/Rb pathway in pyothoraxassociated lymphoma. Cancer Sci,2007［Epub ahead of print］.