细胞凋亡及PCNA与胃癌生物学行为的关系

　　【摘要】 目的：探讨胃癌组织中细胞凋亡、增殖细胞核抗原(PCNA)与胃癌生物学行为的关系。方法：采用原位末端标记法(TUNEL)和SP免疫组化方法分别检测72例胃癌组织中细胞凋亡及PCNA。结果：粘液癌及低分化胃癌组PCNA明显高于高分化组，而凋亡指数明显低于高分化组。胃癌组织浸润超过肌层PCNA较高，而凋亡指数较低。胃癌淋巴结转移组PCNA较高、凋亡指数较低。结论：检测胃癌组织中细胞凋亡及PCNA有助于评估病人的预后。 

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　　【关键词】 胃 癌 增殖细胞核抗原 细胞凋亡

　　The Relationship Between Apoptosis、PCNA and

　　Behaviors of Gastric Carcinoma

　　LV Liang

　　Chengde Health School, Hebei Chengde 067000, China

　　Abstract: Objective: To study the relationship between apoptosis、PCNA and behaviors of gastric carcinoma. Methods: The apoptosis and PCNA were examined by TUNEL and SP immunohistochemical staining respectively. Results: PCNA in mucous carcinoma and low differentiation was significantly higher than that in high differentiation group, while apoptosis index was significantly lower than that in high differentiation. PCNA was positively correlated with invasion depth, while apoptosis index was negatively correlated with invasion depth. The group with lympho node metastasis showed high PCNA and low apoptosis index. Conclusion: PCNA and apoptosis index in gastric carcinoma is contributed to evaluate the prognosis of gastric carcinoma.

　　Key words: Gastric carcinoma; PCNA; Apoptosis

　　细胞凋亡(Apoptosis，apo)是机体进行生理性细胞代谢，清除细胞的重要途径，在淋巴细胞发育分化成熟过程中扮演重要角色，通过apo使可能导致自身免疫疾病的细胞凋亡而加以清除。PCNA存在于细胞核内，是DNA聚合酶的辅助因子，参与 DNA的合成，并在细胞周期中起着重要的调控作用。PCNA的周期性变化与细胞增殖过程有关，目前认为肿瘤的发生与细胞凋亡阻碍、细胞过度增殖有密切关系[1，2]。我们选取消化道常见肿瘤胃癌标本采用原位TUNEL法和SP免疫组化法分别检测细胞凋亡及PCNA，分析二指标与胃癌组织分化、浸润、转移的关系及二指标之间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料：外科手术切除标本72例。标本经100ml/L中性甲醛液固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续切片，同时收集正常胃粘膜蜡块10份，连续切片。TUNEL试剂盒由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)液、荧光素标记的核苷酸标记液和辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体液组成，购自Boehringer Mannheim公司;PCNA抗体系兔抗人PCNA蛋白PCI0抗体为美国ZYMED公司产品，SP试剂盒包括正常羊血清、生物素标记的Ⅱ抗及辣根过氧化物酶标记链霉亲和素Ⅲ抗，购自Zymed公司;显色剂为3，3—二氨基联苯胺(DAB)，由中山生物技术有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原位TUNEL法检测细胞凋亡：切片常规脱蜡入水， 3ml/L H2O2作用10min阻断内源性过氧化物酶，1mg/L蛋白酶K(购自德国Merch公司)37℃消化30min，反应液(含 TdT液50μl，标记液450μl)37℃孵育60min，辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体液37℃孵育30min，DAB(购自美国Zymed公司)显色，苏木素复染，逐级乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。选细胞凋亡阳性片作为对照，用PBS缓冲液替代反应液作阴性对照。

　　1.2.2 SP免疫组化法：切片脱蜡入水，3ml/L甲醇过氧化氢作用5min，非免疫血清阻断30min，依次加入稀释后(1：50)Ⅰ抗PCNA(孵育过夜)，Ⅱ抗(孵育30min)，Ⅲ抗(孵育30min)，期间用PBS缓冲液冲洗，最后于DAB液显色后，复染、脱水、透明、封片。染色时均设立阴性对照(以PBS液代替Ⅰ抗)和阳性对照。

　　1.3 判断标准：细胞凋亡：在光镜下观察，细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。阳性标准：利用凋亡指数作评定标准(为半定量测定)，即1000个细胞中阳性细胞所占百分数。 PCNA：在光镜下观察，细胞核内有深浅不同的棕色颗粒为阳性细胞。阳性标准：随机查看每10个高倍视野，计算阳性细胞数所占总细胞数比例，≥25%者为阳性，<25%者为阴性。

　　1.4 统计学处理：各组阳性表达率差异用X2检验，凋亡指数用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 细胞凋亡、PCNA与胃癌组织分化程度的关系：全部胃癌标本中，凋亡细胞核均呈棕褐色，胞质无着色。计算凋亡指数结果显示：细胞凋亡指数在高/中分化癌组显著高于低分化癌组和粘液癌组(P<0.01，P<0.01)。本研究中PCNA表达阳性细胞为胞核呈棕褐色，胞质无着色，PCNA在正常胃粘膜中的表达 (20.0%)明显低于癌组织中的表达(胃癌组织中平均55.6%)。低分化组和粘液癌组的PCNA表达阳性率均明显高于高/中分化癌组(P<0.05)。表1 细胞凋亡、PCNA与胃癌组织分化程度的关系(略)

　　2.2 细胞凋亡、PCNA与胃癌组织浸润深度及淋巴结转移的关系

　　浸润深度未超过肌层的胃癌组织凋亡指数显著高于全层浸润组(t=4.15，P<0.01);无淋巴结转移组细胞凋亡指数显著高于有淋巴结转移组(t=3.55，P<0.01)。浸润深度未超过肌层组的PCNA阳性率显著低于全层浸润组(P<0.05);无淋巴结转移组PCNA阳性率显著低于有淋巴结转移组(P<0.05)。表2 细胞凋亡、PCNA与胃癌组织浸润深度及淋巴结转移的关系(略)

　　2.3 胃癌组织中PCNA表达与细胞凋亡的关系

　　在PCNA阳性组凋亡指数为明显低于阴性组(t=9.40，P<0.05)。表3 胃癌组织中PCNA表达与细胞凋亡的关系(略)

　　3 讨 论

　　细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由基因调控的细胞主动死亡过程，肿瘤的发生被认为是细胞凋亡，细胞增殖平衡失调的结果。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种酸性核蛋白，其表达和合成与细胞增殖周期有关。PCNA阳性程度可直接反映DNA复制的活跃程度。某些癌基因和抑癌基因通过调控细胞凋亡或(和)影响细胞增殖而影响肿瘤的发生和进展[3]。有研究报道胃癌癌前病变较正常胃粘膜细胞凋亡指数升高，PCNA阳性率升高，发生恶变后凋亡指数降低，PCNA阳性率仍升高，癌前病变凋亡指数升高被认为是机体主动对抗细胞增殖的结果[4，5]。我们的研究结果显示胃癌组织中PCNA的阳性率明显高于正常粘膜。胃癌组织中分化程度越低PCNA阳性率越高，凋亡指数越低;浸润深度越深，PCNA阳性率越高，凋亡指数越低;淋巴结转移组PCNA阳性率高，凋亡指数低，以上结果表明细胞凋亡越少、细胞增殖越快，胃癌的恶性度就越高。此研究结果与范凯[6]等对胃癌研究相似。PCNA的作用在其它癌组织中也得到证实。PCNA阳性组的凋亡指数显著低于阴性组，结合细胞凋亡、PCNA在肿瘤发展中的作用，可以认为 PCNA具有与细胞凋亡相反意义的预测，即凋亡阳性率高的癌组织 PCNA阳性率低，该癌组织恶性度也低，反之亦然。通过本实验研究可以认为：细胞凋亡和PCNA对胃癌的恶性度，淋巴结转移，浸润深度及预后评定有一定意义，PCNA与细胞凋亡负相关，联合检测二者对评估胃癌组织发展及预后有协同作用。

　　【参考文献】

　　[1]沈云芳，庄蕙，沈健伟，等.细胞凋亡与肿瘤[J].世界华人消化杂志，1999，7：267-268.

　　[2]华杰松.幽门螺杆菌，细胞增殖和细胞凋亡在胃癌发生中的作用[J].世界华人消化杂志，1999,7：647-648.

　　[3]杨万才，王立东.肿瘤抑制基因和癌基因在细胞增生调控中的作用机理[J].新消化病学杂志，1997,5：262-263.

　　[4]刘海峰，刘为纹，房殿春，等.胃癌前病变及胃癌中细胞凋亡及其与Fasl表达的关系[J].世界华人消化杂志，1999,7：561-563.

　　[5]刘海峰，刘为纹，房殿春，等.胃癌及其癌前病变中细胞凋亡与细胞增殖间关系的研究[J].世界华人消化杂志，1999，7：649-651.

　　[6]范凯，王坚妹，王朝辉，等.胃癌中hMSH2、p53和PCNA表达的相关性和意义[J].中国肿瘤临床，2005，32(11)：654-656.

　　[7]尹满香，林雪平，方铣华，等. nm23-H1、PCNA、p53蛋白在肺多形性癌组织中的表达及意义[J]. 实用中西医结合临床， 2005，5 (3)：5-7.