维拉帕米和三苯氧胺逆转卵巢癌细胞对阿霉素耐药性的实验研究
【摘要】 目的 了解维拉帕米和三苯氧胺体外逆转卵巢癌细胞阿霉素耐药性的效果及临床意义。方法 分别以阿霉素、维拉帕米和三苯氧胺作用于人卵巢癌亲本细胞SKOV3 和阿霉素耐药细胞SKOV3/ADM后,采用MTT法检测药物对癌细胞的抑制作用，以细胞内阿霉素聚集量测定和流式细胞术检测凋亡。结果 维拉帕米和三苯氧胺能部分逆转耐药细胞对阿霉素的耐药性，且维拉帕米能显著增加耐药细胞内阿霉素的聚集量并促进其凋亡。结论 虽然维拉帕米和三苯氧胺能部分逆转耐药细胞对阿霉素的耐药性，但用于临床的意义不大。
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【关键词】 卵巢癌细胞株;阿霉素;维拉帕米;三苯氧胺;多药耐药
Reversal of adraimycinresistance in ovarian carcinoma cells by verapamil and tamoxifen in vitro
WEI Bing, LI Jiaping
Department of Gynecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China
Abstract: Objective To investigate the reversal effect and clinical significance of verapamil and tamoxifen on adraimycinresistance ovarian carcinoma cell line in vitro. Methods SKOV3 and SKOV3/ADM cell lines were treated with adraimycin, verapamil and tamoxifen, and then the cell inhibition, intracellular adraimycin accumulation and apoptosis were detected by MTT, spectrofluorimetry and flow cytometry, respectively.Results Adraimycinresistance in ovarian carcinoma cells was partly reversed by verapamil and tamoxifen. Verapamil increased the intracellular adraimycin concentration and enhanced the apoptosis in SKOV3/ADM cells. Conclusion Verapamil and tamoxifen could partly reverse adraimycinresistance in ovarian carcinoma cells in vitro, but they have little clinical value.
Key words: ovarian carcinoma cell line; adraimycin; verapamil; tamoxifen; multidrug resistance
阿霉素在上皮性卵巢癌的治疗中具有十分重要的作用。但由于卵巢癌细胞的原发性和获得性耐药常导致化疗效果欠佳或化疗失败。因此，在没有新的抗癌药物问世的情况下，如何逆转肿瘤的多药耐药性，寻找低毒有效的化疗逆转剂、提高化疗效果已成为治疗肿瘤研究的一个重要方向[13]。本文采用钙通道阻滞剂维拉帕米(异搏定，verapamil,VER)和雌激素拮抗剂三苯氧胺(tamoxifen, TAM) 作用于卵巢癌亲本细胞SKOV3和对阿霉素耐药的多药耐药细胞SKOV3/ADM后，采用MTT法检测药物对细胞生长的影响和流式细胞术检测凋亡的发生，以了解逆转卵巢癌细胞阿霉素耐药性的效果。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 卵巢癌细胞系
人体卵巢癌细胞系(亲本细胞SKOV3)由北京大学医学部提供(来自美国Memorial Sloan Kettering Cancer Center，为人类卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌),阿霉素耐药细胞SKOV3/ADM具有多药耐药基因(MDR1)产物Pgp(Pglycoprotein，P糖蛋白)高表达，由本室自建[4]。细胞在含HEPS25mmol/L，谷胺酰胺2mmol/L，青霉素100IU/mL，链霉素100 IU/mL和10%(体积分数)灭活小牛血清的RPMI1640完全培养基中(GIBCO/BRL公司)培养。培养条件：CO2体积分数5%，相对湿度90%，细胞呈单层贴壁生长。
1.1.2 药物和试剂
三苯氧胺(Sigma)以分析纯乙醇溶解后-20℃分装冻存,维拉帕米(Knoll,德国);二甲基亚砜(simethyl sulfoxide ，DMSO，重庆东方红试剂厂)。
1.2 方法
1.2.1 各种药物对SKOV3和阿霉素耐药细胞SKOV3/ADM半数抑制剂量的测定
采用MTT法，用自动酶标仪(Biotech Instrument EL9000型，美国)，测各孔吸光度(A值)。据百分抑制率=(1A处理/A对照)×100%，计算出每一药物质量浓度的百分抑制率。采用加权线性回归法，计算出各种不同质量浓度药物下SKOV3和SKOV3/ADM的半数抑制率(IC50)，阿霉素质量浓度参考人血清峰浓度值(plasma peak concentration,PPC)[5] 0.4mg/L,按对数浓度稀释，三苯氧胺用乙醇稀释后，再以RPMI 1640培养液稀释，保证无水乙醇体积分数<1%，不加药为空白对照。按下列公式求出抑制率和逆转(增敏)倍数和q值：
抑制率=(1观察组A值/未用药A值)×100%
q值=R(甲药+乙药)/R甲药+(1R甲药)XR乙药，当q>1为协同作用，<1为拮抗作用，q=1为相加作用。
逆转(增敏)倍数=化疗剂合用逆转剂IC50/化疗剂单用的IC50。
1.2.2 细胞内阿霉素聚集量测定
采用改良的微量荧光分光光谱法测定卵巢癌细胞内阿霉素聚集量[5]。
1.2.3 凋亡检测
采用流式细胞仪(FACScan,Becton Dickinson，美国)检测凋亡。取以维拉帕米(5mg/L)与阿霉素(0.5mg/L)共同作用72h后的SKOV3/ADM细胞，收集经药物作用的细胞，胰酶消化后计数，用5g/L的PI (Sigma)染液染色，以正常人淋巴细胞调整细胞参数，流式细胞仪(FACScan,Becton Dickinson，美国)检测凋亡。测量的数据输入Macintosh650型计算机上用CellQuest软件分析数据。每次计算10 000个细胞，重复3次，打印结果，包括点图和组方图，并用Modfit1.0软件判断和计算凋亡比例。
1.3 统计学处理
采用Spss10.0统计软件进行单因素方差分析、q检验和χ2检验。
2 结果
2.1 各化疗逆转剂单用时对亲本细胞SKOV3及阿霉素耐药性细胞SKOV3/ADM细胞的抑制作用
MTT法检测表明：当三苯氧胺为10mg/L时，对亲本细胞SKOV3及耐药细胞SKOV3/ADM的抑制率分别为8.0%和5.4%，当维拉帕米质量浓度为≤100mg/L或三苯氧胺<10mg/L时，两种药物对亲本细胞SKOV3及耐药细胞SKOV3/ADM均无明显抑制作用。
2.2 非抑制剂量耐药逆转剂对耐药细胞SKOV3/ADM对阿霉素耐药性的逆转作用
本实验分别以终质量浓度维拉帕米5mg/L、三苯氧胺5mg/L药物与0.01～10×10-6的阿霉素共同作用耐药细胞SKOV3/ADM细胞72h后，以MTT法检测A值，结果见表1。经统计学处理，当阿霉素为1×10-6时，各加药组A值明显低于对照组，P<0.05，详见表1。表1 维拉帕米和三苯氧胺作用于SKOV3/ADM细胞后A值的变化(略)
加以维拉帕米和三苯氧胺培养后，SKOV3/ADM细胞对阿霉素的IC50都显著下降，P<0.05，逆转倍数分别为5.15和3.25，q值均>1，表明维拉帕米和三苯氧胺与阿霉素对多药耐药细胞具有协同作用，维拉帕米和三苯氧胺均能逆转SKOV3/ADM细胞的耐药性，详见表2。表2 维拉帕米、三苯氧胺作用后SKOV3/ADM细胞对阿霉素的耐药情况(略)
以质量浓度为5mg/L的维拉帕米和不同质量浓度的阿霉素作用于SKOV3/ADM细胞1.5h后检测，结果表明维拉帕米能显著增加卵巢癌阿霉素耐药细胞SKOV3/ADM内的阿霉素聚集量 (P<0.01),详见表3。表3 细胞内阿霉素聚集量比较(略)
2.3 凋亡检测
以5mg/L 维拉帕米与0.5mg/L阿霉素共同作用72h，采用流式细胞仪检测，卵巢癌阿霉素耐药性细胞SKOV3/ADM凋亡的发生率为70.65%，显著高于单用阿霉素的33.7%(P<0.01)，而与亲本细胞SKOV3的凋亡发生率(72.95%)差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
临床上对卵巢癌的化疗主要采用铂类(顺铂/卡铂)、烷化剂(环磷酰胺/梅法兰)、抗代谢类化合物(5FU)、生物碱类(长春新碱、长春花碱)和蒽环类(阿霉素及其类似物)等药物的联合应用。而阿霉素广泛用于上皮性卵巢癌的临床治疗。 尽管新型化疗药物紫杉醇目前在临床已得到了广泛的应用，但总的5年生存率却无明显提高，究其原因仍然是肿瘤细胞在多次化疗后出现获得性耐药。因此，在没有新的、更有效的化疗药问世之前，发掘和筛选有效的化疗增敏剂，显得尤为迫切，也是近几年来研究的热点。
3.1 维拉帕米(VER) 逆转SKOV3/ADM细胞耐药的机制
维拉帕米是一种选择性阻滞钙离子经细胞膜的慢通道进入细胞，即减少钙离子内流的药物，现广泛用于心血管疾病的临床治疗。1981年Tsuruo等首次发现非抑制剂量的维拉帕米能逆转肿瘤细胞对长春新碱和长春花碱的耐药性，并延长实验的动物的生存期。以后大量的体外和动物试验均证实维拉帕米在MDR1基因的翻译水平上抑制Pgp的合成及活性，减少Pgp的药物外输“泵”功能，使细胞内药物聚集量增加，发挥化疗药物对肿瘤细胞的毒性作用，维拉帕米与抗癌药物并无明显的结构相似性，小剂量亦无直接的细胞毒性，维拉帕米的逆转作用与钙拮抗作用无关[4，68]。
本实验表明，维拉帕米对亲本细胞SKOV3和SKOV3/ADM细胞并无明显抑制作用，但与阿霉素并用后能显著增加耐药细胞内阿霉素聚集量，使耐药指数(RF)值显著下降，耐药细胞凋亡的发生率(70.65%)显著高于单用阿霉素者(33.7%，P<0.01)，基本上与亲本细胞SKOV3的凋亡发生率相同(72.95%)。故维拉帕米能显著增加多药耐药细胞对阿霉素的敏感性，增加耐药细胞凋亡发生,从而逆转细胞的耐药性。提示维拉帕米是通过增加阿霉素诱导卵巢癌多药耐药细胞调亡而发挥作用的[89]。
3.2 三苯氧胺逆转SKOV3/ADM细胞对阿霉素的耐药性
三苯氧胺为抗雌激素类药物，具有微弱雌激素样作用，能在下丘脑和垂体水平竞争雌孕激素受体，并通过与内源性雌激素竞争结合雌激素受体而发挥抗肿瘤作用，临床上可用于子宫内膜异位症、子宫内膜癌和乳腺癌的治疗。近年实验证实三苯氧胺的抗肿瘤作用还包括抑制蛋白激酶C(PKC)和钙调蛋白，诱导癌细胞周围细胞分泌生长因子等作用,三苯氧胺虽然不是Pgp的底物，但它是以一种特异性的可饱和形式与Pgp上的药物结合位点相结合，改变细胞膜的流动性，改变Pgp的构象，抑制膜泵，从而减少化疗药物的排出，使化疗药物在一定剂量下对肿瘤细胞的杀伤作用增强[1011]。本实验表明，三苯氧胺质量浓度为10mg/L时，对SKOV3/ADM细胞具有一定的抑制作用，非抑制剂量的三苯氧胺(5mg/L)能增加耐药细胞SKOV3/ADM对阿霉素的敏感性，部分逆转其耐药性，与阿霉素有协同作用，但逆转耐药细胞对阿霉素耐药的作用小于维拉帕米。
3.3 筛选耐药逆转剂的临床意义
理想的耐药逆转剂应该是对正常组织没有毒性，药物在体内能达到有效浓度，在体内有稳定而较长的半衰期，能主动代谢。近年研究表明有许多化合物在体外能逆转Pgp的作用，但进入临床实验应用的只有维拉帕米、环孢霉素A、三苯氧胺、奎尼丁、三氟拉嗪、LY335979等几种，但由于这几种化合物体内所需剂量较大，半哀期短，而且药物本身可被细胞内转运系统排出和具有极为严重的毒副作用，因而限制了其在临床中的应用[1014]。本实验的研究结果亦说明维拉帕米和三苯氧胺在体外能部分逆转卵巢癌细胞的获得性耐药性，但逆转所用的维拉帕米和三苯氧胺的质量浓度均大大超过了目前临床的应用剂量(10～20mg)，故不能用于临床。目前，国外对已有的逆转剂进行结构改造，并已开发出一些新的化合物(如维拉帕米的衍生物、双氢吡啶衍生物、环孢霉素衍生行SPC833和RU49953等)，但遗憾的是还仅限于体外实验而不能应用于临床。因此合成新的衍生物和寻找新型逆转剂是今后卵巢癌化疗研究的方向。
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