耳蜗α1D L-型电压门控钙通道剪切异构体的克隆和体外表达研究
【摘要】 目的 克隆大鼠耳蜗毛细胞电压门控钙通道α1D剪切异构体并在体表面达。办法 以耳蜗基底膜中组织总RNA为模板，应用长间隔RT-PCR克隆耳蜗毛细胞表达的电压门控钙通道α1D剪切异构体， 并应用异源表达系统在哺乳动物细胞系停止表达。结果 克隆的耳蜗毛细胞表达的α1D剪切异构体全长cDNA长达6.2kb， 构建了哺乳动物表达载体，树立了稳定表达该剪切异构体的细胞系。 结论 内耳毛细胞表达组织特异性的α1D剪切异构体， 该异构体在外源表达系统中的表达为今后研讨耳蜗α1D L-型钙通道蛋白的电生理和药理特性奠定了根底。
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【关键词】 电压门控钙通道； 耳蜗； 剪切异构体； 克隆； 异源表达系统
Cloning and expressing the inner ear specific splicing isoform of α1D L-type voltage-gated Ca2+ channel in a mammalian cell line
SHEN Wei-dong, HAN Dong-yi
Department of Otolaryngology- Head and Neck Surgery, PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To clone and express the inner ear specific splicing isoform of α1D L-type voltage-gated Ca2+ channel in a mammalian cell line. Methods Using the long-distance RT-PCR and a mammalian expression system, the full length cDNA of the α1D was cloned from cochleae and then expressed in HEK293 cell line. Results We constructed mammalian expression vector which inserted the full length cDNA of α1D（6.2kb） cloned from the rat cochlea, and established a cell line which successfully and constantly expressed it. Conclusion The inner ear expressed a tissue-specific splicing isoform of α1D, and that the cell line constantly expressed this isoform can be used in physiologic and pharmacologic researches of L-type voltage-gated Ca2+ channel expressed in cochleae.
【Key words】 Voltage-gated Ca2+ channel; Cochlea; Splicing isoform; Clone; Heterogenous expression system 电生理学研讨标明内毛细胞表达多种离子通道蛋白，钙通道是其中最重要的通道蛋白之一。电压门控钙通道位于突触前膜，控制内毛细胞钙离子内流和内耳传入突触的递质释放，与听觉信号的产生亲密相关。固然对内耳在体或单离毛细胞的电压门控钙通道的生理特性停止了普遍的研讨，但对毛细胞记载的钙流的分子机制理解较少。在大局部神经突触，递质的释放依赖于N-型或P/Q-型钙通道，电生理学研讨标明内耳毛细胞及内分泌细胞调理递质释放的钙通道属于L-型钙通道，主要是α1D L-型钙通道。固然毛细胞与神经内分泌细胞一样，均经过表达α1D L- 型电压门控钙通道来控制递质的慌张性释放（tonic release），但是在体（in vivo）或单离毛细胞记载到的钙通道的电生理特性与内分泌细胞的钙通道明显不同；另外，至今无论从神经元还是神经内分泌细胞克隆到的多种α1D选择性剪切体在体表面达后均不能完整模仿耳蜗内毛细胞电压门控性钙通道的动力学特性，提示耳蜗α1D钙通道可能具有不同的剪切方式。目前尚未看到克隆并内耳α1D L-型钙通道基因体表面达方面研讨的报导。本研讨从耳蜗基底膜组织克隆大鼠内耳表达的、具有组织特异性的α1D L-型钙通道基因剪切异构体的 全长cDNA，转染哺乳动物来源的HEK293细胞，树立了稳态表达α1D亚单位的细胞系，为今后研讨耳蜗α1D L-型钙通道基因的电生理和药理特性奠定根底。
1 资料与办法
１.１ 实验动物的选取 Sprague-Dawley安康成年大鼠40只，150 g左右，雌雄不限，由解放军总医院实验动物中心提供。
１.２ 取材和总RNA提取 大鼠氯胺酮麻醉后断头处死，疾速取出并翻开听泡，别离耳蜗，浸入冰冷的PBS（0 ~ 4℃）溶液中，解剖显微镜下去除蜗壳、螺旋韧带，别离并取下完好基底膜，立刻置于液氮中速冻。搜集40只大鼠的双侧基底膜组织约35 ㎎，匀浆（PT1200手持式匀浆机，Kinematica公司，瑞士）后用TRIzolR（Invitrogen公司，美国）提取总RNA（按厂家阐明操作），无RNA酶活性的DNA酶消化以降解基因组DNA，酚仿抽提纯化，电泳检测完好性，浓度测试后 - 70℃ 冻存。
1.3 耳蜗L型钙通道全长cDNA的长间隔RT-PCR扩增、克隆和测序 CACNA1D基因全长达6 ～ 7 K，无法一次克隆，只能采取分段克隆（分两段）再衔接的方法。应用LASAGENE TM基因剖析套件的MapDraw软件对GenBankTM大鼠脑α1D序列停止酶切剖析的结果，在3250处BamHⅠ位点的两侧设计引物分别扩增目的片段的5′端和3′端，这样采用BamHⅠ酶切两个扩增片段后再衔接就能够防止引入突变（图1）；为了完成向表达载体的定向克隆（Directed cloning）和进步衔接效率，引物的两端分别引入酶切位点PstⅠ和XbaⅠ，同时酶切位点外侧添加数个维护碱基，进步酶切的 效率。
运用严谨条件使长间隔RT-PCR扩增产物独一（Mastercycler gradient? 热循环仪Eppendorf公司，德国)，即仅表达最多的转录本被反转录和扩增（SuperScriptTM One-Step RT-PCR Kit for Long Templates，Invitrogen公司，美国）。长间隔RT-PCR扩增产物检测后电泳别离、切胶回收，检测定量后衔接到克隆载体（pCR-XL-TOPO TM 长片段PCR克隆载体，Invitrogen公司，美国），并停止克隆质粒的转化和提取。插入耳蜗cDNA片断的质粒分别称为pCR-XL-TOPO-5′和pCR-XL-TOPO-3′。长间隔RT-PCR和RT-PCR产物的克隆的反响条件、反响体系详见厂家阐明书。长间隔RT-PCR扩增的5′端引物：正向引物GCTCTAGAACCTATCAGTAACCTCCCATAC（263-284，下划线为XbaⅠ酶切位点序列），反向引物ATAGTGTTGCGGAAGGAGTGG（3284-3264）；3′端引物：正向引物 AACCACCACATCTTCACCAACC（3181-3202），反向引物CGCTAAAACTGCAGCTTCC- TTGAGGCGTGAAATCA（7113-7093，下划线为PstⅠ酶切位点序列）。
应用克隆载体上的引物M13正反向引物测序一次，选取衔接方向正确的克隆，再依据Gen- BankTM大鼠脑α1D序列，均匀约400个碱基设计一个测序引物（登录号NM_017298）；上述测序反响遗留的gap依据测序结果，另行设计步移引物，最终肯定插入片段的序列（步移引物序列略）。
1.4 哺乳动物表达载体构建 为了把衔接到克隆载体中的目的片段亚克隆到表达载体pcDNA3.1/Zeo(-)中（Invitrogen公司，美国），先用恰当的酶将目的片段分别从pCR-XL-TOPO TM 长片段PCR克隆载体中切下，由于扩增引物中曾经引入PstI和XbaII酶切位点，目的片段和载体有相同的酶切位点，用相同的内切酶线性化载体，就能够把两个目的片段亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/Zeo(-)中。
用PstⅠ、BamHⅠ双酶切后，电泳检测发现pCR-XL-TOPO-5′和pCR-XL-TOPO-3′均完整切开，但是3′端的插入片段CACNA1D-3′和线形化的载体大小类似，均为3.5 kb，电泳后难以别离、回收，遂在克隆载体pCR-XL-TOPO TM选取另一酶切位点Sma I，而插入片段中没有该酶的酶切位点，限制性内切酶Sma I能够把载体降解为1190bp和2330bp两段。这样，运用PstⅠ、BamHⅠ和Sma I三种限制性内切酶（New England Biolabs公司,美国）消化pCR-XL-TOPO-3′，就能够经过切胶回收目的片段CACNA1D-3′。
全部酶切反响体系电泳别离后切胶回收、纯化目的片段（QIAEXⅡ胶回收试剂盒，Qiagen公司，德国）；同样办法纯化酶切后的空载体，以去除酶切产生的小片段，减少载体的自连，进步衔接效率。取2 μl衔接反响产物电转化（BIO-RAD MicroPulser TM电转仪，BIO-RAD公司，美国）One Shot TM TOP10感受态细胞（Invitrogen公司，美国），铺含氨苄青霉素的琼脂凝胶平板培育并克隆化，选取6个克隆停止培育、质粒提取和酶切、测序审定。表达载体pcDNA3.1/Zeo(-)经过测序证明插入片段的大小和方向的正确性。
1.5 HEK293细胞的培育、转染、挑选和审定
表达载体经剖析，确认ORF、起始密码子、终止密码子等表达相关的顺式元件完好，以保证正确的转录和翻译。采用质粒小量制备试剂盒制备转染用高纯度表达质粒（QIAGEN TM Plasmid Mini Kit，Qiagen公司，德国）。
复苏后的HEK293细胞用培育基恰当稀释后，接种到含有100 IU/ml的氨苄青霉素、10% 胎牛血清的DMEM培育基的培育瓶中（GIBCO公司，美国），在37℃、CO2浓度5% 的条件下培育，定时察看生长情况，及时改换培育基，每2 ～ 3天传代一次直至生长状态良好。
转染前一天，293细胞传代，转入6孔培育板中，转染前用无血清的DMEM培育基清洗细胞两次；先用50μl无血清的DMEM培育基稀释DNA（约2 μg pcDNA3.1(-)、1 μg克隆有GFP cDNA 的质粒），悄悄混匀；再汲取5 μl脂质体（Lipofectamin TM，Invitrogen公司，美国），用50 μl DMEM培育基稀释，混匀后室温孵育5min；5分钟后将稀释好的DNA和Lipofectamin TM混和，悄悄混匀，室温孵育30分钟；按每孔100 μl的体积转染细胞，然后把细胞放置到CO2培育箱中孵育（Thermo Forma 3110 SeriesⅡ，美国）。5小时后改换培育基，用含10% 胎牛血清的DMEM培育基继续培育，24小时后传代。
为了取得稳态表达的α1D耳蜗特异性剪切体的细胞系，用抗生素Zeocin（Invitrogen公司，美国）挑选pcDNA3.1(-)转染的HEK293细胞系。转染48小时后细胞传代，改换含有50 μg/ml Zeocin的DMEM选择培育基，每2 ～ 3天改换一次选择培育基并逐步增加抗生素的浓度到50 μg /ml，直到挑选到表达抗性基因的细胞克隆。从培育板中挑出不同克隆的细胞系，转移到96孔板中。稳定细胞系的维持培育时，降低Zeocin的浓度到30 μg/ml，细胞培育到接触时传代，每2 ～ 3天改换一次选择培育基。运用绿色荧光蛋白共转染的作为报告基因，采用RT-PCR的办法在表达程度检测异源表达系统能否胜利表达转染的目的基因。
2 结 果
２.１ 大鼠耳蜗α1D L-型钙通道蛋白基因全长cDNA的克隆
２.１.１ 大鼠耳蜗α1D L-型钙通道的分段扩增结果（图2）
以大鼠内耳总RNA为模板扩增α1D L-型钙钙通道的凝胶剖析显现主要有两条条带，扩增产物经回收、克隆、测序研讨发现两种剪切方式均具有完好的开放读码框，即耳蜗表达的这两种剪切体均可行使功用。为了研讨耳蜗表达α1D L-型钙钙通道主要的剪切异构体的功用，本研讨运用严谨条件停止扩增。
以大鼠耳蜗基底膜组织总RNA为模板，运用严谨条件使长间隔RT-PCR扩增产物独一，分别扩增耳蜗α1D 5′和3′端，扩增产物条带分明，没有明显非特异性扩增（图3）。
2.1.2 耳蜗α1D L-型钙通道蛋白cDNA 5′和3′端的长间隔RT-PCR分段扩增产物的克隆和克隆载体的构建的酶切审定
克隆5′和3′端片段的pCR-XL-TOPO质粒分别经PstI 和BamH I双酶切和Xbal I、BamH I 和 Sma I三种内切酶消化，切胶回收、纯化插入片段，同法用PstI和Xbal I酶切哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)，即可将克隆的α1D的5′和3′端片段定向亚克隆到表达载体中（图4）。
2.1.3 大鼠耳蜗α1D L-型钙通道蛋白全长cDNA表达载体酶切剖析结果（图5）
耳蜗剪切异构体的5′端和3′端插入pcDNA3.1(-)后经酶切剖析，结果显现插入片段约6.1kb，与两个衔接片段之和的大小相当，阐明衔接胜利。
２.２ 大鼠耳蜗α1D L-型钙通道蛋白组织特异性剪切体在哺乳动物细胞系HEK293中的表达
2.2.1 HEK293细胞的培育：正常培育的HEK293细胞呈不规则形，折光率好，贴壁性能和伸展状态良好，可见团结相（图6）。
2.2.２ 耳蜗α1D L-型钙通道蛋白全长cDNA表达质粒与绿色荧光蛋白共转染（瞬态表达）：由于表达质粒中克隆了Zeocin的抗药基因，只要同时表达pcDNA3.1(-)和GFP质粒的细胞系才干在含有抗生素Zeocin的培育基中生长并显现荧光，这样，经过抗生素的挑选，就能够得到胜利表达插入耳蜗CACNA1D异构体基因的细胞系（图7）。
2.2.3 树立稳态表达耳蜗α1D全长cDNA表达质粒细胞系：经过抗生素Zeocin 3周的挑选，大局部细胞被杀死，只要转染胜利、表达Zeocin抗性基因的细胞存活，并构成克隆，克隆化的细胞呈多层生长，细胞生长状态良好，而无抗性基因表达的细胞受损后呈泡状变性，漂浮在培育液中（图8）。
2.2.4 稳态表达耳蜗α1D L-型钙通道蛋白全长cDNA细胞系的RT-PCR审定: 从稳态表达大鼠耳蜗α1D钙通道剪切异构体的HEK293细胞中提取总RNA，应用α1D钙通道基因特异性的引物（引物序列略）停止RT-PCR扩增,能够得到一条700bp的明晰条带（图9），阐明该细胞系在转录程度上表达了耳蜗α1D L-型钙通道基因剪切体。
３ 讨 论
在大局部神经突触（如神经元和神经肌肉接头）递质的释放依赖于N-型或P/Q-型钙通道。与其它神经元突触前膜散布的钙通道不同，内耳毛细胞及内分泌细胞调理递质释放的钙通道对二氢吡啶类钙拮抗剂（Dihydropyridines，DHPs）敏感，故属于L型钙通道［1-3］。典型的L型电压门控的钙通道如心肌细胞表达的α1C钙通道，开放时间长，单通道电导值高（~ 25 pS, ~ 100 mmol/L Ba2+ 作为电荷载体时)，具有Ca2+ 依赖性失活特性，但激活所需的膜电位阈值较高（~ 30 mV），故又称高阈值、高电压激活的钙通道。这类通道对DHPs类的钙通道阻滞剂高度敏感，100 nmol/L的nifedipine（硝苯地平）就能够完整阻滞心肌细胞膜的钙流。
研讨标明内分泌细胞和耳蜗存在的电压门控钙通道主要是α1D L-型（α1D L-type Ca2+ channel, D-LTCC）钙通道，在耳蜗组织中可能还有α1C型钙通道的表达［4］。固然毛细胞与神经内分泌细胞一样，均经过表达α1D型电压门控钙通道来控制递质的慌张性释放，但是在体（in vivo）或单离毛细胞（包括鸡和牛蛙的耳蜗或前庭毛细胞、小鼠耳蜗内毛细胞）记载到的钙通道的电生理特性与内分泌细胞的钙通道明显不同：内毛细胞表达的钙通道具有极低的激活阈值（~ 65 mV，相当于内毛细胞的静息电位），疾速激活（activation,激活时间常数τ =0.1 ~ 0.5 ms）和去激活（deactivation），简直不表现出电压或Ca2+ 依赖性失活的现象［5, 6］，且对DHPs类的钙通道阻滞剂不敏感（10 μmol/L的nifedipine仅能阻断40% 的钙流）［7-8］，这显然与两种细胞的功用差别有关。
另外至今无论从神经元还是神经内分泌细胞克隆到的多种α1D选择性剪切体在体表面达后均不能完整模仿耳蜗内毛细胞电压门控性钙通道的动力学特性［8-10］，目前尚未见到克隆并体表面达α1D型钙通道耳蜗组织特异性剪切异构体的报道。
由于耳蜗组织mRNA模板量的限制，我们无法用PT-PCR办法一次完好克隆耳蜗表达的、长达6 kb的α1D L-型钙通道蛋白基因的全长cDNA，故只能采用分段克隆的战略。依据分段克隆和测序的结果，在目前的研讨中我们从耳蜗中克隆到两种具有完好开放读码框（ORF）的α1D L-型钙通道蛋白剪切异构体，提示耳蜗可能经过组织特异性的剪切机制，由同一个α1D L-型电压门控性钙通道基因产生两种构造和功用不同的通道蛋白［11］。经过序列比对发现，耳蜗表达的α1D钙通道剪切方式与其它组织的剪切方式不同［12］；另外能够在大鼠的全脑（whole brain）和垂体GH3细胞系检测到十余种不同的剪切方式，这可能与α1D L-型钙通道在脑组织不同部位行使不同的功用有关，而钙通道在耳蜗 的功用单一，只与内毛细胞突触前膜递质的释放 有关。
耳蜗的许多构造如基底膜的劲度、毛细胞纤毛的长度及毛细胞自身的膜特性、毛细胞和听觉传入神经的频率特性都与它们感受的声音频率有关，它们的这些特性在耳蜗中的散布有一定规律，称为耳蜗的音频散布图（tonotopicity）。在两栖类和鸟类的基底乳头，K+ 流也存在这样的变化规律，事实上，基于RT-PCR的研讨发现钾流的这种变化的分子机制可能是Slo KCa（BK通道）在基底乳头不同部位表达不同的剪切异构体的结果［13］，据揣测鸡耳蜗cSlo基因能够编码多达576种不同的剪切异构体［14］。但基底乳头记载到的钙流无论是基底区（basal region）还是顶区（apical region），从鸡耳蜗高毛细胞（tall hair cell）记载到的电压门控的钙流在激活电压的范围、药理学特性和钙通道的动力学特性方面均无明显差别［15］；同时，不同的研讨者在前庭或耳蜗的毛细胞上均记载到两种钙流，一种是对DHPs敏感的L-型钙流，相似典型的、其它神经元记载到的L-型钙流，即在高的膜电位下激活（- 40 mV）；另一种为非L-型，它们对钙离子拮抗剂不敏感，能够在更低的膜电位下激活（- 60 mV），并且在中度去极化时不失活，有人以为是N-型［16］，有人把这种钙流归为R-型［17］或其它非L-型钙流［18］。无论是耳蜗的灌流实验［19］、还是基于RT-PCR的表达研讨［20-22］，都标明α1D L-型钙通道即便不是独一的、也是耳蜗表达的最主要电压门控的钙通道；而在另一项研讨中，α1D基因敲除后，CACNA1D功用缺失的小鼠（α1D-/-）呈现毛细胞的退行性变，同时小鼠由于钙流的消逝而呈现重度耳聋，阐明α1D型钙通道构成耳蜗内毛细胞在更低（- 60 mV）的膜电位是钙流激活的［8］。因而我们以为α1D型钙通道是控制耳蜗内毛细胞递质释放的钙通道，同时，该基因在耳蜗经过组织特异性的剪切机制，产生两种不同功用的通道蛋白，经过与β亚单位的互相作用，赋予两种剪切异构体不同于神经元和神经内分泌细胞表达的α1D钙通道的特性，使耳蜗L-型钙通道能够在较低的膜电位时激活、快速的动力学特性，同时在中度去极化时并不表现出明显的失活L-现象［23］。耳蜗表达的具有不同门控特性的两种α1D钙通道剪切异构体可能在不同的膜电位程度激活，分别在静息时和声音刺激时开放，控制内毛细胞传入突触激动的自发性发放和递质的慌张性释放。
应用异源表达系统，转染HEK293细胞树立了大鼠耳蜗α1D L-型钙通道蛋白的的稳态表达细胞系，应用报告基因显现转染胜利，RT-PCR在转录程度证明α1D的胜利表达，今后将应用该细胞系对耳蜗表达α1D L-型钙通道组织特异性钙通道剪切异构体的电生理学和药理学特性停止研讨。
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