胃癌组织中B7H4的表达及其临床意义

　【摘要】目的：探讨B7H4在胃癌组织中的表达及其与临床病理及预后的关系。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术及免疫组织化学染色检测胃癌患者手术切除组织标本中B7H4的表达水平。结果：B7H4 mRNA在20例胃癌组织和癌旁正常组织中均有表达,胃癌组织中表达明显高于癌旁正常组织;在80例胃癌组织中有60例B7H4蛋白呈阳性表达(75%);B7H4蛋白的表达与患者性别、年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、浸润深度无关(均P>0.05);生存期>5年的胃癌患者B7H4蛋白表达阳性率低于生存期≤5年的胃癌患者(P  

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　　【关键词】 B7H4; 免疫组织化学; 逆转录聚合酶链反应; 胃癌; 预后

　　Expression and clinical significance of B7H4 in gastric carcinoma tissues

　　GUO Liting, CHEN Ying,CHENG Yuexin,SHAO Weiwei, GU Xiaoyi JIANG Zao

　　(Department of Oncology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Suzhou Municipal Hospital,

　　Suzhou 215002, China;Yancheng First People′s Hospital, Yancheng 224001, China)

　　[Abstract] Objective: To study the expression of B7H4 in the gastric carcinoma tissues, to investigate the relationship between the expression of B7H4 and the clinicopathological features. Methods: The expression of B7H4 mRNA and B7H4 protein in the gastric carcinoma tissues and nearby normal tissues were detected by RTPCR and immunohistochemistry assay respectively. Result: The expression of B7H4 mRNA was in both gastric carcinoma tissues and nearby normal tissues,the expression of BTH4 in gastyic carcinoma tissues was higher than that in nearby normal tissues. B7H4 protein was found in 60 of 80 patients with gastric carcinoma(75%). There was no relationship between the expression of B7H4 and sex, age, histologic types, tumor size, lymph node metastasia, pathology stage, infiltration depth. In patients more than 5year survival the positive rate of B7H4 protein expression was lower than that in patients less than 5year survival. The number of T infiltrating lymphoid cells in the tumor tissues which expressed B7H4 protein was lower than that in the tumor tissues which did not expressed B7H4. Conclusion: The expression of B7H4 is vital marker in the gastric carcinoma biological behaviors and prognostic judgement.

　　[Key words] B7H4; immunohistochemistry; RTPCR; gastric carcinoma; prognosis

　　B7家族是共刺激分子,属于免疫球蛋白超家族。B7家族的成员包括B7H1、B7DC、B7H2、B7H3和B7H4,它们既有独立的作用,又相互影响。B7家族成员在肿瘤诊断和治疗上的潜在作用越来越明显[1],近年的研究对B7H4尤为关注。Choi等[2]研究表明,B7H4通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期的进程,对T细胞免疫进行负调控。B7H4在大多数正常组织细胞中不表达;在肿瘤组织中高表达,主要通过在肿瘤逃逸中破坏免疫系统发挥作用。本研究应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术及免疫组织化学染色检测B7H4在胃癌组织中的表达,并探讨B7H4蛋白的表达与临床病理特征及预后的相关性及其临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例资料

　　RTPCR检测标本来自于盐城市第一人民医院2008年11月至2009年6月收集的新鲜胃癌组织及癌旁正常组织(距胃癌组织3～5 cm)，各20例。标本离体后立即以液氮保存,然后置-80 ℃冰箱储存。免疫组织化学染色检测标本来自于盐城市第一人民医院2003年1月至2009年6月原发性胃癌患者80例,其中20例胃癌组织为上述RTPCR所选的实验标本。标本均经术后病理确诊为胃癌,其中男54例,女26例,年龄41～78岁。所选标本的患者术前均未进行过化疗和放疗。高、中分化标本24例,低分化标本56例;伴有淋巴结转移者47例,不伴有淋巴结转移者33例。根据TNM分期(UICC,1997),Ⅰ期6例,Ⅱ期28例,Ⅲ期46例。

　　1.2 试剂

　　Trizol(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒(美国Promiga公司),Taq酶(日本TaKaRa公司)。B7H4引物序列,上游为5′GCTCCACTCAGCCAGTAC3′,下游为5′GCTCATCTTTGCCTTCTT3′。内参βactin引物序列,上游为5′TATGACTTAGTTGCGTTACACC3′,下游为5′CCTTCACCGTTCCAGTTT3′。兔抗人B7H4多克隆抗体由北京博奥森生物技术公司进口分装,兔抗人CD3单克隆抗体和鼠抗人CD45单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色剂购于福州迈新生物有限公司。

　　1.3 RTPCR检测B7H4 mRNA的表达

　　按Trizol试剂说明书提取总RNA,紫外分光光度计测定其浓度和纯度,逆转录成cDNA,PCR方法扩增目的基因B7H4及内参βactin。按以下程序进行扩增：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,50 ℃(以引物后退火温度为准)复性45 s,72 ℃延伸1 min，循环35次;72 ℃延伸10 min。取10 μl扩增产物与2 μl 6×loading缓冲液混合后,在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,柯达UV2000紫外分析仪观察和扫描分析。

　　1.4 免疫组织化学染色检测B7H4蛋白的表达

　　所有标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚切片,采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法进行染色,步骤严格按试剂盒说明书进行。以已知阳性胃癌片作为阳性对照,以磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。B7H4浓度为1∶200,CD3和CD45为即用型,微波抗原修复,DAB显色,苏木素复染。在不知患者临床表现的情况下,观察者通过光学显微镜在胞膜上或(和)胞浆内计数阳性染色的细胞个数,分析B7H4的表达情况。在400倍镜下随机选择5个肿瘤区域进行细胞计数。阳性细胞的密度根据阳性细胞的百分比来进行半定量分级：(-)为病灶的表达<10%;(+)为病灶表达10%～40%;(++ )为病灶表达41%～80%;(+++ )为病灶表达>80%。根据染色情况,将这些标本分为两组：阴性组病灶的表达<10%;阳性组病灶的表达为10%～100%。

　　1.5 统计学处理

　　采用Stata9分析软件包,率的比较采用χ2检验和Fisherexact检验;两样本均数的比较采用成组设计t检验,对生存数据采用KaplanMeier法分析并绘制生存曲线,应用Logrank检验差异性。检验水准均采用a=0.05。

　　2 结果

　　2.1 B7H4 mRNA在胃癌组织和癌旁组织标本中的表达

　　胃癌组织和癌旁正常组织B7H4 mRNA均有表达,胃癌组织中B7H4 mRNA的表达高于癌旁正常组织。见图1。M.marker;1、3、5、7.B7H4 mRNA在癌旁正常组织中的表达;2、4、6、8.B7H4 mRNA在胃癌组织中的表达

　　见图2。

　　2.3 B7H4蛋白的表达与临床病理的关系

　　见表1。表1 B7H4在胃癌细胞上的表达与各临床病理变量之间的关系(略)

　　从表1中可见,B7H4的阳性表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、组织学类型、浸润深度、病理分期均无关(均P>O.05)。

　　2.4 B7H4蛋白表达与肿瘤浸润性淋巴细胞数量(tumorinfiltrating lymphocytes, TILs)的关系

　　见图3和表2。

　　80例标本进行CD3免疫组织化学染色,60例B7H4阳性标本中,TILs的数量为25.32±13.35,而20例B7H4阴性表达的标本中,TILs的数量为38.15±18.47,明显高于B7H4阳性表达标本TILs的数量,两者比较差异有统计学意义(t=-2.883 6,P=0.007 8)。

　　本研究中患者的生存时间从手术治疗的当日计算,随访采取门诊复查、电话随访或随诊信调查相结合,随访截止日期为2009年6月30日。本组术后72例获得随访,随访率为90%。这些患者平均生存时间为(56.11±2.34)个月。B7H4阳性表达者54例,平均生存时间(51.66±2.86)个月;B7H4阴性表达者18例,平均生存时间(68.53±1.07)个月,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。Logrank检验发现，B7H4不同表达组之间患者术后平均生存时间存在差异,且差异有统计学意义(P=0.002)。见图5。

　　3 讨论

　　2003年,Sica等[3-5]3个实验室利用生物信息学的方法相继发现了B7H4分子。他们先后以现有的B7家族成员的胞外段可变区(IgV+IgC)为查询序列,对GenBank中的EST序列进行搜索时发现并在人胎盘cDNA文库中得到全长序列。人B7H4的cDNA长约1.8 kb,位于人染色体的1p11.1,在基因组上跨越66 kb,含有6个外显子和5个内含子,第6个外显子存在两种可变剪切形式,由此产生两种不同的剪切本。B7H4 mRNA广泛分布于鼠和人的外周组织,B7H4蛋白在正常组织细胞表面低表达,在造血细胞上却是可诱导的结构。激活的T细胞对B7H4的假定受体进行正调节。B7H4与T细胞结合起来对细胞的生长、细胞因子的分泌和细胞毒性的发生有较强的抑制作用,从而抑制了细胞周期。

　　B7H4是共刺激分子,参与T细胞介导免疫应答的负性调控。研究已经发现，B7H4表达于卵巢癌[6]、乳腺癌[7]、肾细胞癌[8]、子宫内膜癌[9]、非小细胞肺癌[10]、结直肠癌[11]、脑肿瘤[12]和胰腺癌[13]。本实验检测了B7H4蛋白在人类胃癌组织中的表达，并分析其与临床病理之间的关系,免疫组织化学染色显示B7H4蛋白表达阳性率为75%,B7H4蛋白表达与患者性别、年龄，胃癌组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、浸润深度无关(P>O.05)。RTPCR方法检测发现，B7H4 mRNA在胃癌组织及癌旁正常组织中均有表达,胃癌组织中B7H4mRNA的表达高于癌旁正常组织。B7H4有促恶性的潜能,它通过一种来自正常细胞介导的免疫监视的保护机制促进肿瘤的进程。B7H4可能与肿瘤形成、细胞转化和生长、肿瘤免疫逃逸相关。

　　本组72例有确切随访资料的胃癌患者中，生存期>5年的胃癌患者B7H4的表达阳性率(61.9%)显著低于生存期≤5年的胃癌患者B7H4的表达阳性率(93.3%)。生存曲线分析提示B7H4高表达者预后较差。胃癌中B7H4的高表达,降低了机体对肿瘤细胞的特异免疫力,影响了患者的预后,使患者的中位生存期逐渐缩短。提示B7H4在肿瘤免疫中可能作为一种负性调节因子起作用,B7H4可以反映患者免疫状态和预后情况。

　　TILs是浸润性实体肿瘤的主要免疫组成部分,Sun等[10]研究发现,在非小细胞肺癌中B7H4高表达与TILs呈负相关。结直肠癌组织中B7H4的表达抑制了结直肠癌中TILs的数量,封闭结直肠癌中B7H4有可能成为结直肠癌免疫治疗的新策略[11]。Sica等[3]通过固相化的抗CD3单克隆抗体模拟抗原对T细胞的第一信号,分析了B7H4交联对T细胞激发作用,实验结果提示B7H4抑制了T细胞反应。本实验通过CD3和CD45免疫组织化学染色发现,B7H4阳性标本中TILs低于B7H4阴性标本中的TILs。肿瘤细胞高表达B7H4可以降低肿瘤细胞对淋巴细胞的刺激能力,抑制抗原特异性的细胞毒性T细胞(CTL)对肿瘤细胞的杀伤作用,有利于肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视，有利于肿瘤形成。B7H4在肿瘤细胞的表达可以作为肿瘤微环境中的逃逸机制的一部分,导致了肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。

　　B7H4通过抑制CTL杀伤活性来负性调节T细胞的免疫应答,而且可以促进上皮细胞的恶性转化,保护表皮细胞免于失巢凋亡,可能在肿瘤的发生、发展中发挥一定的作用，但其在T细胞表面的特异性受体还需进一步研究。B7H4在多种恶性肿瘤中有表达,在正常组织中低表达。B7H4蛋白能促进肿瘤的生长,而且可作为单克隆抗体治疗的靶点。本实验结果表明，B7H4与胃癌相关,B7H4有望成为胃癌诊断的新标记,在胃癌的免疫治疗中成为新靶点,对胃癌的预后及评价有着重要的作用。

　　【参考文献】

　　[1] FLIES D B, CHEN L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity[J]. J Immunother,2007,30(3):251260.

　　[2] CHOI I H, ZHU G, SICA G L, et al. Genomic organization and expression analysis of B7H4, an immune inhibitory molecule of the B7 family[J]. J Immunol, 2003,171(9):46504654.

　　[3] SICA G L, CHOI I H, ZHU G,et al. B7H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity[J]. Immunity, 2003,18(6):849861.

　　[4] ZANG X, LOKE P, KIM J,et al. B7x: a widely expressed B7 family member that inhibits T cell activation[J] . Proc Natl Acad Sci,2003,100(18):1038810392.

　　[5] PRASAD D V, RICHARDS S, MAI X M, et al. B7S1, a novel B7 family member that negatively regulates T cell activation[J]. Immunity, 2003,18(6):863873.

　　[6] SIMON I, KATSAROS D, RIGAULT DE LA Longrais I, et al. B7H4 is overexpressed in earlystage ovarian cancer and is independent of CA125 expression[J]. Gynecol Oncol, 2007,106(2):334341.

　　[7] SALCEDA S, TANG T, KMET M, et al. The immunomodulatory protein B7H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation[J]. Exp Cell Res, 2005,306(1):128141.

　　[8] KRAMBECK A E, THOMPSON R H, DONG H, et al. B7H4 expression in renal cell carcinoma and tumor vasculature: associations with cancer progression and survival[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(27):1039110396.

　　[9] MIYATAKE T, TRINGLER B, LIU W, et al. B7H4 (DDO110) is overexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor Tcell infiltration[J]. Gynecol Oncol, 2007,106(1):119127.

　　[10] SUN Y, WANG Y, ZHAO J, et al. B7H3 and B7H4 expression in nonsmallcell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2006,53(2):143151.