腺病毒携带EGFP基因经完整圆窗膜转导豚鼠耳蜗的实验研究
【摘要】 目的 研讨腺病毒携带目的基因经完好圆窗膜途径耳蜗转导的可行性及平安性,为内耳基因治疗提供实验根底和理论根据。办法 20只白色红目豚鼠，术前及术后分别行听性脑干反响（ABR）检查。实验组（12只）以重组腺病毒携带的加强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein，EGFP），对照组（8只）以人工外淋巴液注入豚鼠圆窗龛内。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片，耳蜗冰冻切片察看。结果 于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因的转导办法对听力无明显影响。转染耳蜗及对侧耳蜗内目的基因呈普遍表达。5天组表达产物最高，14天组逐步降低。对照组耳蜗未见EPFP表达。结论 于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因转导的办法对耳蜗无明显毒害作用,且可以将目的基因胜利转导至双侧耳蜗组织并普遍表达。
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【关键词】 基因转导； 圆窗膜； 腺病毒； 豚鼠； EGFP
Cochlear Ad-EGFP expression by transferred gene through an intact round window membrane in guinea pigs
ＣＨＥＮ Wei1, YANG Shi-ming1, GUO Wei1, HU Yin-yan1, SUN Jian-he1, HAN Dong-yi1,
ZHAI Suo-qiang1, YANG Wei-yan1, HE Zhi-zhou2
1 Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Institute of Otolaryngology, Chinese
PLA General Hospital, Beijing 100853, China
2 Department of Biomedical Sciences, Creighton University, 2500 California Plaza, Omaha, NE 68175, USA
【Abstract】 Objective To investigate delivery of recombinant abenoviruses-erhanced green fluorescent protein（Ad-EGFP） into the guinea pig cochlea through an intact round window membrane（RWM）, and to assess the side-effect of the management. Methods Twenty adult guinea pigs were used for the study: 12 were implanted with Ad-EGFP in the bony groove of the round window niche, and 8 were implanted with artificial perilymphatic fluid. Auditory brainstem response（ABR） thresholds were determined in all animals before and 5 days after surgery. On postoperative day 5 and day 14, the animals were sacrificed and the surface preparation of cochleae was observed. Results ABR measurement showed that the operation had no deleterious effect on hearing. Bright green fluorescence in the cochleae was observed in Ad-EGFP groups. Gene expression was at a high level 5 days after operation and reduced 14 days later. However, control groups were free of fluorescence. Conclusion The technique of transgenic delivery into the inner ear through an intact RWM is feasible, atraumatic and effective.
【Key words】 Gene transfer; Ｒound window membrane; Adenovirus; Ｇuinea pig； EGFP
在哺乳动物听觉系统中，耳蜗毛细胞作为觉得神经的终末细胞，能够将声音刺激转换成电信号，并经过听觉神经传导至中枢，维持正常的听力。而过度声刺激、老化、耳毒性药物、感染及本身免疫性疾病等多种要素均可引发耳蜗毛细胞的不可逆性损伤，从而招致永世性的感音神经性耳聋。既往研讨标明，虽然在鸟类和低等脊椎动物中，毛细胞损伤后能够修复或再生，但在成熟哺乳动物耳蜗尚未能完成毛细胞的再生及听觉功用的恢复[1]。不过，近年来经过外源性基因的诱导、促分化作用使成年哺乳动物内耳毛细胞再生的研讨和应用，排战了成年哺乳动物内耳毛细胞不能再生的观念［2］。但由于耳蜗构造的特殊性，如何平安、高效地将目的基因转导至耳蜗内而又不毁坏耳蜗的完好性成为一个难题。本研讨采用完好圆窗膜处腺病毒携带目的基因导入的办法，使目的基因经圆窗膜浸透转染内耳，而不毁坏耳蜗构造的完好性。结果显现目的基因在耳蜗中表达明显，为以后的内耳基因导入治疗打下了根底。
1 资料与办法
1.1 资料 携带加强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein , EGFP）的重组腺病毒［3，4］ （Ad-EGFP，美国gene 公司，高维强博士惠赠）。
1.2 动物分组 安康成年白色红目豚鼠20只，雌雄不限，体重250 ～ 300g（由解放军总医院实验动物中心提供）。随机分红两组，实验组12只，对照组8只。一切动物均以左耳作为实验耳。
1.3 听性脑干反响（ABR）阈值测试 各组动物分别于术前及术后5天应用美国智能公司Intelligent Hearing System Smart EP2.22 系统，行双侧ABR阈值测试。刺激声用短声(click)，滤波带通80 ～ 3 000 Hz，叠加次数512次，扫描时间10 ms。动物用长春军需大学兽医研讨所消费的速眠新（曾名846）按0.3 ml／kg体重麻醉，37℃保温袋保温。电极设置为：颅顶为记载极，测试耳为参考极，鼻尖处为地线。
1.4 手术操作 动物用速眠新按0.3 ml／kg体重麻醉，37℃ 保温袋保温。麻醉后，在严厉无菌条件下，左侧耳经背侧进路显露听泡，在手术显微镜下用电钻翻开听泡，暴露圆窗龛。用 5 μl 微量注射器将5 μl Ad-EGFP（实验组）或人工外淋巴液（NaCl 137 mmol／L，KCl 5 mmol／L，MgCl21 mmol／L，NaHPO4 1 mmol／L，NaHCO3 11 mmol／L，葡萄糖11 mmol／L）（对照组）注入圆窗龛内，然后取一小块枯燥的明胶海绵封锁听泡，分层缝合切口。
1.5 耳蜗铺片标本的制造与察看 术后5天、14天赋别处死动物（实验组每次处死3只，对照组每次处死2只），疾速取出双侧听泡，暴露耳蜗，于解剖显微镜下在蜗尖挑开一小孔，捅破圆窗膜，并将镫骨轻推入前庭池以翻开前庭窗，汲取4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH 7.4）经蜗尖灌注固定耳蜗，然后将耳蜗置于4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液中4℃避光固定2小时，基底膜铺片，激光共聚焦荧 光显微镜（Radiance 2100，Bio-Rad公司）下察看EGFP的表达状况。
1.6 耳蜗冰冻切片标本的制造与察看 术后5天、14天赋别处死动物（实验组每次处死3只，对照组每次处死2只），4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH 7.4）经心脏灌注，至动物四肢生硬，口鼻惨白。疾速取出双侧听泡,暴露耳蜗，汲取4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH 7. 4）行蜗尖灌注固定耳蜗。经脱钙，脱水，OCT胶包埋处置后，行冰冻切片。整个过程留意避光。荧光显微镜下察看。
1.7 碘化丙啶荧光染色 铺片及切片标本参加细胞核特异染料碘化丙啶（propedium iodide，PI， Sigma公司）复染，室温避光10分钟，PBS冲洗10 min × 3次。荧光防淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜下察看。
1.８ 统计学办法 运用SPSS统计剖析软件，数值用x ± s表示，组间比拟采用方差剖析，样本均数间的两两比拟采用最小显著差数法两两比拟。
2 结 果
2.1 术前及术后5天ABR阈值测试结果 术后5天，手术耳及对侧耳ABR阈值，实验组与对照组动物比拟无显著性差别（P > 0.05）；手术耳、对侧耳ABR阈值与术前比拟无显著性差别(P > 0.05）（表1）。
2.2 术后耳蜗的肉眼察看所见 术后5天和14天取材时见动物中耳腔内清洁，未见中耳及内耳炎症、出血等反响。圆窗膜完好，无充血。5天组圆窗龛内有少量渗出物，14天组圆窗龛内无渗出物。
2.3 耳蜗内EGFP的表达 共聚焦荧光显微镜下可见，实验组耳蜗内呈现亮堂的绿色荧光，内、外毛细胞，支持细胞，螺旋神经节细胞胞体内均可看到EGFP的表达（图1-a、c）。荧光强度从底回向顶回逐步削弱。术后5天的表达产物较高,荧光强度较强（图1-d）；荧光强度在14天时明显削弱。对照组双侧耳蜗未见EGFP表达（图1-f）。PI复染察看，实验组可见外毛细胞点状缺失（图1-e），对照组内、外毛细胞未见缺失。
3 讨 论
内耳基因转导的实验研讨目前国内外主要采用将携带目的基因的载体经圆窗膜或经耳蜗基底转开窗（鼓阶）灌入两种方式，但这两种转导方式，其基因表达较局限，且有惹起耳蜗损伤以致听力进一步降落的风险。在实践应用过程中,还有操作不便,易损伤四周重要构造的缺陷［5， 6］。另一种经脑脊液基因转导是以脑脊液为媒介，经耳蜗水管抵达双侧内耳。但动物实验标明，目的基因在耳蜗的表达与应用载体的量有较大的依赖性，且多局限在双侧蜗底程度，并有较多散布在脑组织的底面，对脑组织的潜在风险增加，临床应用遭到限制［7］。
本实验应用耳蜗的解剖特性及圆窗膜为具有通透性的半透膜的生物特性［8］，采用了一种微创的基因转导办法：只将腺病毒携带的EGFP基因注射到圆窗龛内，使其透过圆窗膜渗入到耳蜗内，不毁坏耳蜗构造的完好性。这样就防止了侵袭性圆窗膜操作难以封堵，构成淋巴瘘的风险，而且减少了药液从圆窗膜外渗的可能［9， 10］。此办法手术操作简单，创伤小，对耳蜗的构造及正常的生理功用影响较小。实验结果显现，术后5天和14天动物中耳腔内清洁，未见中耳及内耳炎症、出血等反响。实验组外毛细胞点状缺失，对照组内、外毛细胞未见缺失。实验组和对照组动物术前、术后ABR阈值无显著性差别（P > 0.05），阐明导动手术操作自身对听力无不良影响，但病毒自身有一定的生物毒性，对临近导入部位的毛细胞可能形成轻度损伤，但未惹起听功用改动。
本研讨所应用的载体 —— 腺病毒转染率高（可达100%），能感染团结或不团结的细胞，易于增殖和纯化，滴度高，不整合到宿主细胞基因组内而相对平安等特性也显现出较好的应用前景［11，12］。实验结果显现，术后5天耳蜗内即呈现目的基因的普遍表达，内、外毛细胞，支持细胞，螺旋神经节细胞胞体内均可看到EGFP的表达。荧光强度从底回向顶回逐步削弱。标明腺病毒载体携带的目的基因可经内耳淋巴液扩散至整个耳蜗区域，但存在区域基因表达不平均的状况，即在注射部位四周基因表达较强，间隔远则较弱。一方面，可能是因内耳淋巴液循环代谢十分迟缓；另一方面，改造后的缺陷性腺病毒可能不易透过内、外淋巴间隙之间的膜性构造。而且动物的不同组织细胞存在不同的病毒受体，决议了病毒对组织细胞的亲嗜性。病毒对细胞的吸附普通在几分钟至几非常钟内完成，病毒吸附过程除受病毒的吸附蛋白和特异性的细胞受体带电荷状态和分子构造影响外，还受许多环境要素如湿度、离子、pH 以及病毒侵入细胞方式差别等的 影响［13］。
本实验还察看到导入后14天，荧光强度较5天时明显减低。这可能是由于现阶段所用的重组腺病毒均为复制缺陷型，不易整合到宿主基因组中，因而转基因的表达是短暂的［14］。另外，病毒在注入动物体内后，能产生大量的早、晚期蛋白，惹起宿主产生免疫反响，从而疾速予以肃清，这也是表达短暂的缘由之一。有的学者把重组腺病毒与免疫抑止剂一同运用，延长了表达时间。因而，如何完成腺病毒载体携带的外源基因在体内长时间表达，需求进一步研讨。
我们在实验中还察看到对侧未注入病毒耳，在相应部位也可见到绿色荧光。一种可能是经过蜗核沿神经纤维传到对侧耳［15］，另一种可能是经过脑脊液循环抵达对侧耳蜗，但确切的途径和机理还需求进一步的研讨。不过，这一现象提示单侧内耳基因导入，治疗双侧内耳疾病的可能。
选择合理的用药途径和平安的给药办法对内耳疾病的治疗具有特别重要的意义［16］。本实验研讨尝试的办法相关于其他侵入性的办法，是一种微创、比拟平安的基因导入办法，更适用于人类临床的基因转导治疗。但尚需进一步完善，一些问题如对转导前后听阈变化的察看不应只局限于click而应做各个频率不同时间点的系统察看，基因转导效率的量化，以及在药物或噪声致聋的内耳中基因表达的部位及时间点有何异同等，还需求进一步深化 研讨。
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