薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞侵袭迁移能力的影响及其机制

　【摘要】目的：研究不同浓度薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞株的侵袭、迁移能力及CD44、CD133表达的影响。方法：以不同浓度薏苡仁酯作用于BGC823细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,黏附试验、Transwell小室侵袭迁移实验检测细胞黏附、侵袭、迁移能力,RTPCR法检测细胞CD44、CD133 mRNA表达水平。结果：薏苡仁酯可抑制BGC823细胞增殖,其抑制效应呈剂量时间依赖性;经薏苡仁酯作用后BGC823细胞的侵袭、迁移及黏附能力降低;CD44、CD133 mRNA的表达与薏苡仁酯浓度亦呈负相关。结论：薏苡仁酯能降低胃癌BGC823细胞株的侵袭、迁移、黏附能力,其机制可能与通过下调CD44、CD133表达有关。  

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　　【关键词】 薏苡仁酯; 胃癌; 侵袭; 迁移; 黏附; CD44; CD133

　　Effects of coixenolide on invasion and metastasis capacity of gastric carcinoma BGC823 cells in vitro and its mechanism

　　WANG Min,JIANG Zao

　　(Department of Oncology,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China)

　　[Abstract] Objective:To investigate the effect of coixenolide on adhesion,invasion and metastasis of gastric carcinoma BGC823 cells in vitro and its mechanism.Methods:MTT assay was used to examine the effect of coixenolide on proliferation of BGC823 cells.Matrigel adhesion assay and Transwell chamber were performed to determine the adhesion,invasion and migratory capacity of the cells.RTPCR was applied to detect the expression of CD44 and CD133 mRNA in BGC823 cells.Results:Coixenolide could inhibit the proliferation of BGC823 cells with obvious dosedependent and timedependent effects.Coixenolide significantly inhibited adhesion,invasion and migratory capacity of BGC823 cells in vitro.After coixenolide treatment for 24 h,the expression level of CD44 and CD133 mRNA was decreased in a dosedependent way.Conclusions:Coixenolide can inhibit the migration, invasion and adhesion capacity of BGC823 cells in vitro. The inhibition effect may be related to downregulating the expression of CD44 and CD133.

　　[Key words] coixenolide; gastric cancer; invasion; metastasis; adhesion; CD44; CD133

　　薏苡仁酯注射液是一种从传统中药薏苡仁中提取的抗肿瘤新药,研究[1]证实，它对多种肿瘤细胞有抑制增殖、促进凋亡、抑制肿瘤血管生成等作用。目前有研究[2-3]提示,肿瘤干细胞表面标记物CD44、CD133与胃癌侵袭、转移等恶性生物学行为可能有密切相关。薏苡仁酯对CD44、CD133的影响尚未见报道。本研究旨在观察薏苡仁酯对胃癌细胞株BGC823黏附、侵袭、迁移等生物学行为及CD44、CD133表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1 材料

　　1.1.1 细胞株及培养液

　　胃癌细胞株BGC823由中国科学院上海细胞生物学研究所引进,1640培养基购自GIBCO公司,胎牛血清购自杭州四季青公司。

　　1.1.2 主要药品及试剂

　　薏苡仁酯注射液由浙江康莱特药业有限公司提供,四氮唑蓝、二甲基亚砜均为Sigma公司产品,Transwell小室为Corning公司产品(24孔,8 μm孔径),Trizol为美国Invitrogen公司产品,逆转录试剂盒为美国Promiga公司产品,Taq酶为日本Takara公司产品,引物合成由上海生工生物公司提供。PCR扩增仪型号为Eppendorf 7501S,凝胶成像仪为北京天能公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　人胃癌细胞株BGC823以含10%胎牛血清的RPMI 1640在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,每天换液1次,0.25%胰酶消化传代。

　　1.2.2 MTT法检测薏苡仁酯对BGC823细胞增殖的影响

　　将对数生长期细胞稀释为5×104 ml-1的密度,每孔200 μl接种于96孔细胞培养板。薏苡仁酯组的终浓度均依次为5、10、15 μl·ml-1,同时设立阴性对照组。分别培养24、48和72 h后检测MTT值，实验终止4 h前加入四氮唑蓝溶液20 μl。弃去上清液,每孔加入DMSO 150 μl,在振荡器上振荡10 min后用酶标仪检验A490 nm值。抑制率=(平均对照组A490 nm-平均药物组A490 nm)/平均对照组A490 nm×100%。实验重复3遍。利用IC50计算器计算出IC50。

　　1.2.3 细胞黏附试验

　　分别收集经5 μl·ml-1薏苡仁酯作用24 h及对照组的细胞悬液,调配浓度为1×105 L-1,96孔培养板覆以10 μg matrigel,每孔加悬液0.2 ml。培养30、60、90、120 min后弃去未黏附细胞。PBS液轻洗2遍后剩余贴壁细胞为黏附细胞计数。按时间点随机取3孔求平均值,计算不同时间的细胞黏附率,计算公式:细胞黏附率=黏附细胞数/总细胞数×100%。

　　1.2.4 Transwell小室侵袭实验

　　Transwell小室被孔径为8 μm的聚碳酸多孔滤膜分为上下两室,在滤膜上铺以500 μg matrigel,于37 ℃下重建基底膜,风干1 h后备用。将薏苡仁酯组及对照组细胞分别用含0.1%胎牛血清的1640培养基调配成1×106 ml-1细胞密度,下室加10%胎牛血清的1640培养基600 μl,上室加入100 μl细胞悬液。37 ℃培养24 h,侵袭置滤膜下表面的细胞用结晶紫染色后,随机选择5个200倍显微视野,以平均数作为穿膜细胞数来表示BGC823细胞的侵袭能力。

　　1.2.5 Transwell小室迁移实验

　　实验步骤大体同细胞侵袭实验,差异在于聚碳酸多孔滤膜表面未铺matrigel ,其余步骤和方法相同,仍随机选择5个200倍显微视野统计滤膜下表面的细胞数目,以细胞的相对数目来表示肿瘤的迁移运动能力。

　　1.2.6 RTPCR测定CD44、CD133 mRNA水平变化

　　收集经薏苡仁酯终浓度为5、10及15 μl·ml-1处理24 h后的细胞及阴性对照组细胞,紫外分光光度计定量总RNA,按试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA,用βactin做为内参照进行PCR。每个样本至少重复3遍。引物(由上海生工生物工程公司合成):CD44的引物序列上游为5′CAACAGTGGCAATGGAGC 3′,下游为5′GATTCGCAATGAAACAATCA 3′,扩增长度286 bp。CD133的引物序列上游为5′ACCTGCGTAAC TCCATCT 3′,下游为5′TTGTCCGACCAGTTCTTC 3′,扩增长度379 bp。βactin的引物序列：上游为5′TA TGACTTAGTTGCGTTACACC 3′,下游为5′CCTTCAC CGTTCCAGTTT 3′,扩增长度155 bp。取10 μl cDNA,用上海生物工程公司的PCR扩增试剂盒进行PCR,体系25 μl。94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循环35次,72 ℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖电泳。凝胶成像仪摄片并分析其灰度值,计算各个样本CD44和CD133表达水平,受检基因mRNA表达量的相对值=待测基因扩增条带的灰度值/βactin基因扩增条带的灰度值。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理。数据用x-±s表示,计量资料采用单因素方差分析,组间多重比较采用q检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT比色法观察薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞的增殖抑制作用

　　见图1。

　　薏苡仁酯作用时间相同时,随着药物浓度的增加,其细胞生长抑制率显著增加,薏苡仁酯各浓度组之间比较差异有统计学意义(P<0.01);薏苡仁酯作用剂量相同时,随着作用时间的增加,其细胞生长抑制率显著增加,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。这表明薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞的抑制作用呈时间、剂量依赖关系。

　　2.2 不同时间点薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞的侵袭、迁移、黏附能力的抑制作用 见表1、2。表1 不同时间点薏苡仁酯对BGC823细胞的黏附率影响，表2 薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞株侵袭和迁移能力的影响(略)

　　由表1可见，在不同时间点，薏苡仁酯组BGC823细胞黏附率均值显著低于对照组(P<0.01)。由表2可见，薏苡仁酯对BGC823细胞侵袭、趋化运动能力有抑制作用。

　　2.3 薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞株中的CD44、CD133表达的影响

　　经浓度为5、10及15 μl·ml-1薏苡仁酯处理后,CD44、CD133 mRNA在胃癌BGC823细胞株中的表达下降,并随着薏苡仁酯浓度增加,表达逐渐下降(图2、3),两组间差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨论

　　胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，术后转移和复发是导致患者死亡的主要原因。恶性肿瘤转移是肿瘤治疗的主要障碍，控制转移是决定癌症预后的关键因素之一。

　　CD44是一种跨膜受体蛋白，可与透明质酸等配体结合，介导细胞与细胞及细胞外基质之间的黏附。高表达CD44分子的肿瘤细胞通过与细胞外基质中的透明质酸、血管内皮细胞的黏附，从而具备更高的侵袭和迁移能力[4]。Nishii等[5]在易形成腹膜转移瘤、具有高黏附能力的胃癌细胞株及侧群细胞中发现CD44等黏附分子的高表达，提示CD44可能在胃癌腹膜转移中发挥着重要作用。另外有研究发现，在胃癌细胞株中，CD44阳性胃癌细胞株能在无血清培养基中形成克隆球，当其被注入重症联合免疫缺陷小鼠胃内及皮下时亦能致瘤，显示出干细胞自我更新和分化潜能的特征，而将CD44基因敲除后则显著降低了致瘤性，因此得出了CD44可能为胃癌干细胞表面标记物之一的结论[2]。

　　CD133亦属于跨膜糖蛋白家族，它的具体功能目前尚不清楚，存在于C端的酪氨酸暗示它可能是通过酪氨酸残基磷酸化作用而发挥级联效应的生长因子受体。用组织芯片技术检测胃癌组织及癌旁组织CD133的表达，发现CD133的表达与肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移数目、TNM分期和出现腹腔及远处转移相关，CD133阳性组患者的5年生存率低于阴性组[5]。定量流式细胞分析发现，胃癌细胞株等肿瘤细胞表面CD133分子表达水平比正常上皮细胞及骨髓造血祖细胞高，而鼠抗人CD133抗体能抑制胃癌和肝癌细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，体内试验亦证实CD133抗体能抑制肿瘤进展[3]。

　　由此不难看出，CD44、CD133既为多种肿瘤干细胞表面标记物，又与胃癌细胞侵袭、转移等恶性生物学行为以及胃癌的临床病理特征、预后等显著相关，因此抑制CD44、CD133表达可能可以抑制胃癌细胞增殖，降低其侵袭转移能力。薏苡仁酯为具有抑瘤、免疫调节、抗病毒等多种药理活性的中药提取物，临床已广泛应用于非小细胞肺癌、原发性肝癌、胃癌等恶性肿瘤的综合治疗。本研究发现，薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞株有显著的抑制增殖作用，且抑制作用呈剂量、时间依赖性。薏苡仁酯还能显著降低胃癌BGC823细胞株的黏附、侵袭、转移能力,下调胃癌BGC823细胞CD44、CD133 mRNA的表达,且随着药物浓度增加,CD44、CD133 mRNA表达水平逐渐下降。因此,本实验结果提示，薏苡仁酯对胃癌BGC823细胞株增殖、黏附、侵袭及转移等方面的作用可能通过下调表面黏附分子CD44、CD133的表达而发挥功能。

　　【参考文献】

　　[1] 魏晓蓉.薏苡仁化学成分及抗肿瘤活性研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(3):135138.

　　[2] TAKAISHI S, OKUMURA T,TU S P,et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44[J].Stem Cells, 2009,27(5):10061020.

　　[3] SMITH L M,NESTEROVA A,RYAN M C,et al.CD133/prominin1 is a potential therapeutic target for antibodydrug conjugates in hepatocellular and gastric cancers[J].Br J Cancer,2008,99(1):100109.

　　[4] NAOR D,WALLACHDAYAN S B,ZAHALKA M A,et al.Involvement of CD44,a molecule with a thousand faces,in cancer dissemination[J].Semin Cancer Biol,2008,18(4):260267.

　　[5] NISHII T,YASHIRO M,SHINTO O,et al.Cancer stem celllike SP cells have a high adhesion ability to the peritoneum in gastric carcinoma[J].Cancer Sci,2009,100(8):13971402.

　　[6] 李亚卓,王凤华,赵坡.CDl33、Ki67在胃癌的表达及临床病理意义[J].世界华人消化杂志,2008,16(28)：31673171