辛基酚对MCF7乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响

【摘要】  目的 察看辛基酚对MCF7乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响。办法 以MTT实验、流式细胞剖析、免疫细胞化学和RTPCR等办法察看辛基酚对MCF7乳腺癌细胞增殖、细胞周期相和细胞凋亡、CDK2和CDK4 mRNA表达、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达的影响。结果 4、8、16μmol/L OP作用MCF7乳腺癌细胞72h时，细胞增殖率分别为107.31%、168.06%、62.00%，G0/G1期细胞分别为(52.46±6.67)%、(50.19±7.39)%、(67.31±5.47)% ，对照组(55.27±7.53)%，细胞凋亡率分别为(4.84±1.12)%、(6.48±1.36)%、(19.26±3.57)%， 对照组(5.56±1.125)%，16μmol/L OP减少了细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1的表达。结论 4、8μmol/L OP促进MCF7乳腺癌细胞增殖，16μmol/L OP则抑止细胞增殖，促进细胞凋亡，这可能与OP影响细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1表达有关。

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【关键词】  乳腺癌;辛基酚；细胞周期蛋白1；细胞周期依赖性激酶类

 Effect of Octylphenol on Cell Cycle and Cyclin Expression on MCF7 Breast Cancer Cells

    PENG Junhua, ZHANG Huaxin, ZHANG Feng, ZHAO Yong, FAN Hongyan

    Department of Clinical Laboratory, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, PLA,Lanzhou 730050, ChinaAbstract：Objective   To observe the effect of octylphenol(OP) on cell proliferation, cell cycle and cyclin expression of MCF7 breast cancer cells.Methods  Using MTT test, flow cytometry, immunocytochemistry and RTPCR to observe the changes of cell proliferation, cell cycle, apoptosis, CDK2,CDK4 and Cyclin D1 mRNA expression, Cyclin D1 protein expression of MCF7 cells.Results  When MCF7 breast cancer cells were treated with 4，8 and 16μmol/L OP on 72h, the proliferation ratio of MCF7 was 107.31%、168.06% and 62.00% respectively, MCF7 cell at G0/G1 were (52.46±6.67)%、(50.19±7.39)% and (67.31±5.47)% respectively,while control group was (55.27±7.53)%. The apoptosis ratio of MCF7 was (4.84±1.12)%，(6.48±1.36)% and (19.26±3.57)% respectively，and the control group was (5.56±1.125)%. The expression of CDK2,CDK4 and Cyclin D1 mRNA significant decreased when MCF7 breast cancer cells were treated with 16μmol/L OP, the expression of Cyclin D1 protein decreased too.Conclusion  The proliferation of MCF7 breast cancer cells increases when treated with 4，8μmol/L OP, but  it decreases when treated with 16μmol/L OP. These different effects on MCF7 cells maybe related to the expressive regulation of CDK2, CDK4 and Cyclin D1.

    Key words：Breast cancer; Octylphenol; Cyclin D1; Cyclindependent kinases

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率呈上升趋向，乳腺癌的发病与遗传、雌激素和环境要素有关。辛基酚（octylphenols，OP）是一种具有雌激素活性的化工产品，在低浓度时能促进MCF7乳腺癌细胞的增殖，高浓度时却抑止MCF7细胞的增殖[1]。细胞增殖与细胞周期亲密相关。本研讨将OP作用于MCF7细胞，察看细胞的增殖和CDK2、CDK4、Cyclin D1表达的改动，讨论OP影响MCF7乳腺癌细胞增殖的作用机制，为乳腺癌的防治提供根据。

    1  资料与办法

    1.1  试剂

    辛基酚，纯度>98%，Sigma公司产品。兔抗人抗体Cyclin D1 (运用浓度为1∶75)，羊抗兔SP试剂盒，北京中杉公司产品。RTPCR试剂盒，上海Sangon公司产品。二甲亚砜(DMSO)，纯度>98%，进口分装试剂，用于配制OP。

    1.2  MCF7细胞培育及分组

    人乳腺癌MCF7乳腺癌细胞由中科院上海细胞所提供。实验前将乳腺癌MCF7细胞在无酚红的DMEM/F12中培育24h以耗尽细胞的内源性雌激素，然后以该培育基停止实验。实验分为四组：对照组（Con），给予DMSO、 4μmol/L OP组(OP4)、8μmol/L OP组(OP8)、16μmol/L OP组(OP16)。

    1.3  MTT实验

    参见文献[2]，以492nm波长测定活细胞的吸光度（A），增殖率（PR）= 实验组A值/对照组A值×100%。

    1.4  细胞周期相检测

    实验各组细胞处置72h，收获细胞，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测。

    1.5  Cyclin D1蛋白表达检测

    细胞生善于小盖玻片上，多聚甲醛固定，血清封锁，加一抗于37℃孵育50 min，按SABC试剂盒操作，DAB显色，脱水、透明，显微镜察看并照相，数据剖析。

    1.6  荧光定量PCR检测CDK2、CDK4和Cyclin D1的mRNA表达

    收获OP作用48h细胞，用Trizol试剂一步法提取总RNA，逆转录为cDNA。引物由上海生工公司合成，用荧光杂交探针标志。CDK2：5′GCT CTC ACT GGC ATTCCT CCT3′，5′CGA AAT GAA GGC ACT AGA GC3′；CDK4：5′CTA CCT CTC GAT ATG AGC CAG T3′，5′CAT CTG GTA GCT GTA GAT TCT G3′；Cyclin D1：5′GAG GAA CAG AAG TGC GAG GA3′，5′TCT GGA GAG GAA GCG TGT GA3′。取样本总cDNA 3μl、上游和下游引物各1.5μl，参加试剂盒其他成分，用PE Gene Amp 5700 荧光PCR检测仪停止剖析。反响条件为94℃ 40s、60℃ 40s、72℃ 40s，40个循环。

　　1.7  统计学办法

    数据用±s表示，组间差别性比拟用SPSS 10.0软件停止单要素方差剖析。

    2  实验结果

    2.1  辛基酚对MCF7 乳腺癌细胞增殖的影响

    4、8μmol/L的OP能促进MCF7乳腺癌细胞增殖,16μmol/L 的OP却抑止细胞增殖；OP作用72h，MCF7乳腺癌细胞的增殖率分别为107.31%、168.06%、62.00% ，见表1。表1  OP对MCF7乳腺癌细胞增殖的影响 n=3, *P<0.01，vs Con2.2  辛基酚对MCF7乳腺癌细胞周期相散布的影响

    流式细胞剖析结果显现，OP对细胞周期的影响较小，16μmol/L OP将MCF7乳腺癌细胞阻滞于G1/G0期，72h时细胞凋亡率明显增加，见表2。表2  OP对MCF7乳腺癌细胞周期相的影响

    2.3  OP对MCF7乳腺癌细胞中Cyclin D1蛋白表达的影响

    16μmol/L OP明显下调MCF7乳腺癌细胞中Cyclin D1表达，8μmol/L OP上调MCF7乳腺癌细胞中Cyclin D1表达，见图1。

    2.4  OP对MCF7乳腺癌细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA表达的影响

    8μmol/L OP能促进MCF7乳腺癌细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA表达，高浓度(16μmol/L)OP则抑止细胞中CDK2、CDK4、Cyclin D1 mRNA表达，见表3。表3  OP对MCF7乳腺癌细胞中CDK2、CDK4、 Cyclin D1 mRNA表达的影响 (对数值)

    3  讨论

    乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，严重要挟着妇女的安康和生命。在过去50年中，乳腺癌发病率增加了2倍，1940年以来，美国的乳腺癌发病率每年递增1%。乳腺癌的发病与遗传、生殖、雌激素、营养、电离辐射等多种要素有关。环境雌激素是指可以模仿或干扰机体内源性雌激素的合成、分泌、转运、分离、排泄、生理作用等一类外源性化学物质。辛基酚是一种具有雌激素活性的化工原料，主要用于消费非离子外表活性剂、增塑剂、热稳定剂等，普遍存在于生活、工作环境的水体、淤泥、土壤和食品如鱼类、贝类、饮水及饮料中 [3]。OP具有生殖、发育毒性，青春期前大鼠较长期接触OP会惹起成年大鼠精子细胞凋亡，降低雄性生育才能[4]，增加激素依赖性肿瘤发病 [5]。本研讨发现低浓度(4、8μmol/L)的OP能促进MCF7乳腺癌细胞的增殖，高浓度 (16mol/L) 的OP抑止MCF7乳腺癌细胞的增殖。这与以前报道的低浓度(4、8μmol/L)的OP能抑止MDAMB231乳腺癌细胞增殖不分歧[2]，这可能与所采用的乳腺癌细胞株不同有关，与前人研讨结果相分歧[1]。

    细胞增殖依赖于细胞周期的顺利停止，细胞经有丝团结，将细胞一分为二，该过程受G1/S、G2/M两个关健点调控。研讨发现OP经过下调Bcl2和 Caspase3表达，诱导Sertoli细胞[6]和MDAMB231乳腺癌细胞凋亡。本研讨发现低浓度OP对细胞周期相没有明显影响，高浓度OP将细胞阻滞于G0/G1期，细胞凋亡明显增加，这与植物雌激素三羟异黄酮将MCF7乳腺癌细胞阻滞于G2/M不一样。

    细胞周期的正常停止与细胞周期调控蛋白和细胞周期依赖性激酶的正常表达亲密相关。Cyclin DCDK是G0/G1期的限速步骤。当生长信号传到细胞周期调控时，Cyclin D转录速度加快，使Cyclin D表达增加量和稳定性增加。Cyclin D激活CDK4，释放出E2F，驱动细胞周期的停止。过度表达Cyclin D能加速细胞经过G1期，使细胞增殖加速。Koroxenidou等[7]发现17羟雌二醇经过减少CDK2、CDK4的表达及降低CDK2的活性，将细胞阻滞于G1/S期。本研讨发现高浓度的OP作用MCF7乳腺癌细胞，能下调CDK2、CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达，降低Cyclin D1蛋白的表达，将细胞阻滞于G1/S期，抑止细胞增殖，促进细胞凋亡，OP表现细胞毒性。低浓度OP经过上调CDK2、CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达，细胞周期加速，促进细胞增殖，OP表现雌激素活性。

【参考文献】
  ［1］ Han D,Tachibana H,Yamada K.Inhibition of environmental estrogeninduced proliferation of human breast carcinoma MCF7 cells by flavonoids [J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2001,37(5):275282.

[2] 彭俊华，张峰，张华欣，等.辛基酚对MDAMB231乳腺癌细胞周期及周期蛋白表达的影响[J].第四军医大学学报，2006,27(24):22392241.

[3] 彭俊华，张峰.辛基酚对机体安康的影响及其机理的研讨停顿[J]. 西北国防医学杂志，2004,25(6):445446.

[4] Kim SK,Lee HJ,Yang H,et al. Prepubertal exposure to 4tertoctylphenol induces apoptosis of testicular germ cells in adult rat [J].Arch Androl，2004,50(6):427441.

[5] Yoshida M,Katsuda S,Tanimoto T,et al.Induction of different types of uterine adenocarcinomas in Donryu rats due to neonatal exposure to highdose octylphenol for different periods [J].Carcinogenesis，2002,23(10):17451750.

[6] Qian J,Bian Q,Cui L, et al.Octylphenol induces apoptosis in cultured rat Sertoli cells [J].Toxicol Lett，2006,166(2):178186.

[7] Koroxenidou L,Ohlson LC,Porsch HI.Longterm 17 alphaethinyl estradiol treatment decreases cyclin E and cdk2 expression,reduces cdk2 kinase activity and inhibits S phase entry in regenerating rat liver [J].J Hepatol,2005,43(3):478484.