采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体

【摘要】  目的 研制抑止肺癌细胞功用性单抗，为治疗肺癌提供靶向治疗剂，并为别离取得肺癌相关的分子靶标打下根底。办法 重新鲜人肺癌组织别离肿瘤细胞免疫Bal b/c小鼠，免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞交融后接种于甲基纤维素，制备大容量功用性抗体库。采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤增殖、侵袭、黏附、动物体内治疗实验等办法挑选审定抑止肿瘤细胞的功用性单抗。结果 本次交融共取得了1573株杂交瘤克隆，在能与肺癌细胞膜反响的314株克隆中，154株与正常肺组织不反响或低反响。功用性挑选发现41株单抗显著地抑止肺癌细胞增殖，24株能抑止肺癌细胞对Matrigel的侵袭，15株能抑止肺癌细胞与Collagen I的黏附，进一步实验考证了2株单抗能在体内抑止肺癌移植瘤的生长。结论 采用大容量功用性抗体库技术胜利取得了多株具有抑止肺癌细胞恶性生物学行为的功用性单抗，其中2株可能具有靶向治疗肺癌的应用潜力。

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【关键词】  肺癌；抗体库；功用性单抗；靶向治疗

    肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，在欧美等兴旺国度,其发病率在各种常见肿瘤中居首位[1]。我国亦是肺癌的高发国度，每年死于肺癌的人数超越40万，且有明显的逐年递增趋向。虽然近年来肺癌的治疗手腕有了较大进步，但是患者的5年生存率仍低于15%[2]。近年来美国FDA批准Herceptin和Avastin等单抗靶向药物作为一线抗癌药计划用于乳腺癌和转移性结肠癌的治疗，已在临床上获得了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了一种全新的战略。本研讨采用本室树立的高通量研制挑选功用性单抗的技术办法，取得了多株能显著抑止肺癌细胞增殖的功用性单抗，为治疗肺癌提供了有潜在应用价值的抗体靶向治疗剂。

    1  资料和办法

    1.1  资料

    小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0细胞，肺癌细胞系GLC82（肺腺癌）、NCIH520（肺鳞癌）为本室保藏。6周龄Bal b/c小鼠购自中国药品生物制品检定所。 M199、M1640、DMEM、IMEM培育基均购自Gibco BRL公司； 胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）系Hyclone 消费；biotin马抗小鼠IgG、IgM、HRP标志羊抗小鼠IgG、IgM 均购自Vector公司；αtublin兔多抗为Santa Cruz 消费；FITC标志的羊抗兔 购自Vector 公司；Cy3标志avidin 购自Jackson公司; PVDF膜由Millipore消费；DAPI购自Sigma公司；单抗亚类检测试剂盒均由SouthernBiotech公司消费；SP法免疫组化试剂盒购自福州迈新公司；Westernblot试剂购自普利莱公司。

    1.2  办法

    1.2.1  细胞培育  SP2/0细胞采用含10%FBS的DMEM培育基培育；肺癌细胞系GLC82和NCIH520采用含10%FBS的1640培育基培育。

    1.2.2  动物免疫  采用临床别离的肺癌新颖组织标本(鳞癌、腺癌各一个) 别离单个细胞，以1×106～5×106细胞/（只·次）的剂量免疫5只Bal b/c小鼠，连续免疫12个月。

    1.2.3  免疫荧光  活细胞免疫荧光：将9000/孔肿瘤细胞接种于96孔培育板，37℃、5%CO2温箱培育2天。细胞约70%集合后，用PBS洗濯每孔中的细胞后参加一定浓度的一抗，室温孵育1 h，含1%BSA的PBS洗濯5次，每次5 min；参加60μl含0.5μg/ml biotin标志二抗或60μl含0.5μg/ml FITC标志抗体室温孵育30min，1%BSA的PBS洗濯5次，每次5min；参加 60μl 1∶1000稀释的Cy3Avidin，室温孵育30min后，PBS洗濯5次，每次5min；最后用含10μg/ml DAPI的50%甘油50μl封锁。关于固定细胞间接免疫荧光，在参加一抗前细胞经4%多聚甲醛固定10min，0.2% Triton X100通透5min，后续实验操作同活细胞免疫荧光。上述实验中，每种单克隆抗体反复做3孔。

    1.2.4  细胞交融  待免疫小鼠血清滴度到达1∶60 000以上时，取1×108 免疫小鼠脾细胞与2×107处对数生长期的杂交瘤细胞系SP2/0交融。交融后接种30个于铺有甲基纤维素的直径35mm的细胞培育皿内。置湿盒中于5%CO2 、37℃温箱中培育。

    1.2.5  免疫组织化学  免疫组化采用SP法。杂交瘤上清采用1∶5和1∶25两个稀释度。操作程序严厉依照试剂盒阐明书操作，镜下阳性细胞<10%定为阴性。

    1.2.6  ELISA  采用SouthernBiotech的单抗亚类ELISA检测试剂盒测定挑选取得的单抗亚型，操作严厉依照试剂盒阐明书停止。

    1.2.7  肺癌细胞增殖测定  采用MTT法检测免疫小鼠血清对人肝癌内皮细胞增殖的影响。并同时采用RTCESTM(Real Time Cell Electronic Sensing System ) 细胞增殖测定仪实时监测单抗对人肝癌内皮增殖的作用[3]，细致按厂家阐明停止操作。在细胞接种后8～16 h，参加1∶2稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清（阴性对照），继续监测细胞生长状况。细胞增殖进入平台期前终止实验，依据监测数据计算杂交瘤上清对细胞生长抑止的影响，上述实验反复了3次。

    1.2.8  抗体的侵袭抑止实验  100μg/cm3 的BD Matrigel包被Corning Costar transwells的多孔的聚碳酸酯膜，37℃、5%CO2温箱中包被30min后，每孔4×104人肺癌细胞系GLC82接种于transwells中。接种细胞后在transwells中参加1∶5稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清。在37℃ 、5%CO2 培育24h后，镜检察看肿瘤细胞穿过多孔的聚碳酸酯膜后，刮除多孔的聚碳酸酯膜上层未穿过的肿瘤细胞。然后用1∶1的甲醇/丙酮溶液固定膜上细胞20min。侵袭的细胞用DAPI染核，在荧光显微镜下计数侵袭细胞数。每张膜察看4个不同的100倍视野，并经SPSS10.0停止统计剖析，上述实验反复3次。

    1.2.9  抗体的黏附抑止实验  96孔培育板经100μg/cm3的Collagen I包被，37℃、5%CO2温箱中包被30min后，每孔4×104人肺癌细胞系GLC82接种于96孔培育板，接种细胞后在6孔培育板中参加1∶5稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清。在37℃、5%CO2 培育1h后，每孔参加250μl无血清1640培育基振荡洗濯，每次5min，共计洗濯3次，以洗去未黏附的肿瘤细胞。随后，运用MTT法测定黏附细胞数，经SPSS10.0停止统计剖析，上述实验反复了3次。

    1.2.10  体内抑瘤实验  将BALB/C裸鼠分为抗体治疗组，正常鼠IgG为对照组，每组6只。将人肺癌细胞系GLC82按100万细胞/只小鼠的比例接种一切各组的BALB/C裸鼠皮下。接种后5天（已能扪及肿瘤时）开端腹腔注射纯化抗体停止治疗。注射剂量200μg/(次·只)，治疗第一周，每天1次，连续5天，以后每周2次。20天时处死小鼠，测瘤重，计算肿瘤生长抑止率。

    2  结果

    2.1  小鼠免疫血清的测定

    从食管癌新颖组织标本中别离单个细胞，免疫Balb/c小鼠5只，分别于免疫后3、5、9、11、13个月从小鼠尾静脉取血别离血清。免疫后9个月时固定细胞免疫荧光检测小鼠血清的抗体滴度为1∶20 000～1∶60 000。其中4号小鼠血清滴度最高，为1∶60 000，见图1a。尔后两次采血检测免疫血清的抗体滴度不再显著升高，准备交融。

    用MTT 法检测这只小鼠免疫第9个月的免疫血清对人肺癌细胞增殖的抑止作用，结果如图1b。随着血清浓度的增加，免疫血清对肺癌细胞增殖的抑止作用增加，并呈现明显的量效关系。1∶50稀释的免疫鼠血清对人肺癌细胞增殖的抑止达43%，而1∶50稀释的正常鼠血清对人肺癌细胞增殖没有明显的抑止作用，标明该免疫血清中含有能显著抑止人肺癌增殖的功用性抗体。

    2.2  细胞交融及阳性克隆的挑选

    待免疫小鼠血清中的抗体滴度不再升高时，取滴度最高的4号小鼠脾细胞与SP2/0细胞停止交融，交融细胞接种40个含有HAT选择培育液的甲基纤维素培育基的平皿中。培育8～12天后，从培育皿中挑取孤立的较大的细胞集落，共计挑取2652个单集落细胞克隆，接种30个96孔培育板，最终从中取得了1573个单克隆。以αtublin作为细胞膜能否被通透的对照，采用活细胞免疫荧光法检测挑选了1573个杂交瘤克隆上清与2种肺癌细胞系GLC82和NCIH520的反响。假如对照αtublin的免疫荧光阳性则阐明细胞膜曾经被通透，抗αtublin的抗体分子进入了细胞；假如αtublin为阴性，阐明细胞没有被通透，抗体无法进入细胞内，见图2。因而，这时的阳性反响标明该抗体是与细胞膜上的蛋白分离，即此抗体的抗原是膜蛋白，此抗体也可能作为抗肺癌靶向治疗的抗体。最终我们取得了314个与2种肺癌细胞膜均呈阳性反响的克隆。采用免疫组织化学法检测了上面314个阳性克隆的杂交瘤上清与正常肺组织的反响性，结果取得了154个与正常肺组织不反响或低反响的单抗克隆。

    2.3  抗肺癌单抗抑止肺癌细胞的增殖、侵袭和黏附

    采用肿瘤细胞增殖测定、DB Matrigel侵袭测定及Collagen I黏附实验对经过活细胞免疫荧光及免疫组化挑选取得的154株克隆单抗停止功用性的挑选，审定这些单克隆抗体对GLC82细胞增殖、侵袭、黏附的影响。有41株单抗能明显抑止肺癌细胞GLC82的增殖，其中抑止率最高的单抗9C10到达55%±3%；24株单抗能抑止GLC82对Matrigel的侵袭，其中抑止率最高的单抗4E2到达68%±8%；15株单抗抑止肺癌细胞GLC82对Collagen I的黏附，其中抑止率最高的单抗14A12到达50%±11%。其中154株单抗中有4株单抗（9D12、5A3、6C4、15E11）对肺癌细胞的增殖、侵袭和黏附均有一定的抑止。图3显现了局部单抗对肺癌细胞增殖、侵袭及黏附的影响。

    2.4  功用性单抗的亚类审定

    采用单抗亚类检测试剂盒检测了其中25株具有功用的单抗的亚类，结果发现其中有5株IgG1、4株IgG2a、1株IgG2b、8株 IgM。还有2株为混合克隆。

    2.5  抗肺癌单抗显著抑止肺癌移植瘤生长

    选择对肺癌细胞增殖和侵袭最强的单抗各1株，停止了体内抑瘤实验。在单抗治疗起始后20天（接种肿瘤后25天）处死动物，获各组肿瘤称瘤重，计算各组的均匀瘤重。正常鼠IgG治疗组均匀瘤重为0.843±0.320，9C10治疗组的均匀瘤重为0.426±0.306，4E2治疗组的均匀瘤重为0.466±0.266，9C10和4E2对肿瘤瘤重的抑止率分别为49.4%和47.9%，其P值均小于0.05，有显著统计学意义。标明这2株抗体在体内均能显著抑止人肺癌的生长，见图4。

    3  讨论

    近年来，靶向肿瘤细胞功用基因/蛋白靶标的治疗战略越来越遭到人们的注重，并且获得了较大的

    A.9C10单克隆抗体抑止GLC82细胞的增殖;B.4E2单克隆抗体抑止GLC82细胞对Matrigel的侵袭;C.12F7单克隆抗体抑止GLC82细胞对I型胶原黏附(×200)

    各实验组和对照组的瘤重

    停顿。如赫赛汀（抗HER2人源化单抗）治疗乳癌[4]、美罗华（抗CD20人源化单抗）治疗淋巴瘤[5]、格列卫（酪氨酸激酶抑止剂）治疗慢性粒细胞白血病、胃肠道间质瘤[6]、阿瓦斯汀（抗VEGF人源化抗体）治疗大肠癌[7]。

    经过树立大容量的单抗库挑选取得肿瘤相关的功用基因和靶点曾经被证明是一条可行且高效的技术道路，并越来越遭到关注。2004年，Eustace等报道了经过这一办法取得了3个肿瘤转移相关的功用性基因[8]。另外，该技术还被报道胜利地挑选审定了肺内皮膜蛋白相关功用性基因和食管癌内皮膜蛋白相关功用基因[9,10]。

    为了树立抗肺癌的大容量功用性单抗库，本研讨从肺癌（鳞癌和腺癌）新颖组织标本中别离单个肿瘤细胞，免疫Bal b/c小鼠。用免疫血清直接停止肺癌细胞增殖的功用实验，发现免疫血清稀释1∶1 000 时仍能显著抑止肺癌细胞GLC82的增殖；而正常鼠血清在1∶50时也不能抑止肺癌细胞GLC82的增殖，标明免疫血清中含有能抑止肺癌细胞恶性生物学行为的功用性抗体。因而，我们制备的大容量单抗库将可能含有可以抑止肺癌的功用性单抗。

    为了得到大容量单抗库，本文改进了传统的单克隆抗体制备办法，树立和完善了高通量制备和挑选阳性单抗的技术办法，最终取得了库容为1573个克隆的单抗库。采用活细胞免疫荧光实验和免疫组化法检测这些阳性克隆与人正常肺组织切片的反响，取得了154株能较特异与肺癌细胞反响而不与正常肺组织反响的克隆。功用性的挑选发现了能显著抑止肺癌细胞增殖、侵袭、黏附的功用性抗体。这些研讨结果标明本文树立和优化的高通量制备抗肿瘤的功用性单克隆抗体库的办法不只能够取得大量抗肿瘤细胞膜蛋白的单抗，还能取得抑止肿瘤细胞各种恶性生物学行为的功用性抗体。

    在临床上运用的靶向药物中，抗Her2 的抗体类药物赫赛汀可以经过抑止乳腺癌细胞的增殖而明显的抑止乳腺癌患者的肺转移等[11]。肿瘤细胞的转移取决于其侵袭才能的强弱，因而抑止肿瘤细胞的侵袭将可以抑止其转移。抑止肿瘤细胞的侵袭才能也可以抑止肿瘤原发瘤的生长[12]，这可能是由于原发瘤的生长也需求瘤灶边缘的细胞不时向四周侵袭的缘故。我们在能显著抑止肺癌增殖和侵袭的功用性单抗中分别选择了抑止作用最强的单抗9C10和4E2停止了体内抑瘤实验。结果两株单抗均能显著抑止GLC82细胞移植瘤的生长，标明两株单抗均有作为抑止肺癌生长和转移单抗治疗剂的潜力。

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