附睾和睾丸冷冻精子行卵胞浆内单精子注射临床效果的初步分析
【关键词】 卵胞浆
自1992年卵胞浆内单精子注射（ICSI）［1］问世以来，完成了男性少、弱，畸形精子症患者取得遗传学后代的愿望，1993年Schoysman等［2］报道了无精子症患者应用睾丸精子行ICSI取得胜利。尔后，经皮附睾抽吸（PESA）、睾丸切开（TESE）行ICSI已作为有正常生精的梗阻性无精（OA）或睾丸衰竭的非梗阻性无精（NOA）及不射精患者常规治疗办法。临床上，无精子症患者在扫除遗传性疾病的根底上普通首先要停止附睾或睾丸的诊断性活检，其参数可预测附睾或睾丸内能否有精子。为了防止在其后的ICSI周期中重复的睾丸手术形成的血行阻断和可能的永世性损伤，能够将前期诊断性睾丸活检获取的精子或ICSI治疗周期所剩余的微量活精子停止冷冻保管，然后择期行ICSI治疗。本研讨回忆性剖析了本中心停止的冷冻附睾或睾丸精子复苏后行ICSI治疗的有效性，并与新颖睾丸精子相比拟。
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1材料与办法
1.1普通材料回忆性剖析了2007年9月~2008年1月应用冷冻复苏后的附睾、睾丸精子行ICSI 5个周期（4PESA，1TESE），新颖附睾、睾丸精子行ICSI 41个周期（27PESA，14TESE），共46个周期。46对男性梗阻性无精的不育夫妇中2例为不射精，11例为先天性输精管缺如，6例为附睾结核，1例先天性右侧输精管缺如伴左侧隐睾，其他均为缘由不明的无精子症。肯定无精至少需3次射出的精液标本离心处置并检测沉淀。
1.2卵巢刺激给予长效促性腺激素释放激素相似物（GnRH-a）抑止垂体，重组促性腺激素（FSH）刺激卵巢，诱导多个卵泡生长，B超监测卵泡发育状况，当至少有2个优势卵泡直径到达17 mm后，停用GnRH-a 和FSH；予以绒毛膜促性腺激素（HCG）5000~10000 IU肌注后32～36 h后，在B超引导下经阴道穹隆穿刺取卵。去除卵冠丘复合物外的颗粒细胞，MⅡ期成熟卵子待行ICSI。
1.3精子的获取PESA：部分麻醉下，患者采取仰卧位，常规消毒，铺巾，将附睾固定于阴囊皮下，用已预先抽进少量培育液的1 ml BD注射器于肉眼直视下穿刺附睾头并负压抽吸，直至针管内有淡黄色混浊附睾液体抽出。如未见液体抽出，则改动穿刺点。将附睾液注入培育皿，在倒置显微镜下寻觅活动精子。如镜下未见活动精子，则再次穿刺取精或行对侧附睾穿刺，若仍无精子，则思索TESE法取精。TESE：部分麻醉下，在阴囊皮肤做一个小切口，穿过腹膜鞘膜在白膜上做一个或多个小切口，切取一块睾丸组织放入1006培育液（美国 Quinns产品）中，室温下坚持15 min，洗濯2次，在解剖显微镜下用两个无菌BD注射器将睾丸组织撕碎，在倒置显微镜下检验一滴悬液，检测有无精子。
1.4精子悬液的制备和冷冻检测到活动精子的附睾悬液或睾丸组织悬液，参加到含3 ml 1006培育液Falcon试管中，2次离心（600 g，5 min），弃上清，参加0.1 ml 1006培育液，稀释混匀。放入37 ℃ 5.5%CO2培育箱内孵育（留意紧盖），待行ICSI。如ICSI后所剩余精子数目足以再行ICSI，则将剩余精子加以冷冻；诊断性活检则将精子2次离心洗濯处置后直接冷冻。将精子冷冻维护液8020（美国 Quinns产品）和精子悬液按体积1∶1比例混匀，分装入冷冻管中，在液氮气相中暴露15 min，最后投入液氮冷冻保管。
1.5冷冻精子复苏和ICSI取卵日有成熟卵子即可复苏附睾或睾丸冷冻精子，从液氮中取出冷冻管，疾速将其投入37 ℃水浴中5 min，后用1006培育液离心洗濯2次（600 g，5 min），沉淀用0.1 ml 1006培育液混匀，放入37 ℃ 5.5%CO2培育箱内孵育1 h（留意紧盖），在倒置显微镜下检验一滴复苏的悬液，检测有无活动精子。有活动精子在取卵后4 h行ICSI。
1.6受精、胚胎评价和胚胎移植ICSI后18 h察看受精，正常受精可察看到双原核和两个明晰或碎裂的极体，后24 h、48 h察看胚胎团结状况，取卵后第3天选择优质胚胎移植，移植后14天检测HCG，如阳性，则为生化妊娠，再于移植后35天测血β-HCG升高，B超检查显现妊娠囊、见胎心搏动则为临床妊娠。
1.7统计学办法采用SPSS软件对数据停止统计学剖析，计量材料用t检验，计数材料用χ2检验，P＜0.05以为差别有统计学意义。
2结果
回忆性剖析了46对男性梗阻性无精的不育夫妇，共46个促排卵周期，行冷冻复附睾或睾丸精子ICSI 5个周期（4PESA，1TESE），行新颖附睾或睾丸精子ICSI 41个周期（27PESA，14TESE）。冻精组男性均匀年龄为（32.2±5.2）岁，女性均匀年龄为（30.0±5.0）岁；对照组男性均匀年龄为（32.5±5.4）岁，女性均匀年龄为（30.0±5.3）岁。见表1。比照两组ICSI的受精率、卵裂率和优胚率，未显现有统计学差别（P>0.05）。冻精组共移植5个周期，妊娠4例，继续妊娠3例，宫外孕1例；对照组共移植39个周期，放弃移植2个周期（1个为未卵裂，1个为患者有OHSS高风险），妊娠17例，继续妊娠15例，流产2例。冻精组临床妊娠率和胚胎种植率明显高于对照组，但差别亦无统计学意义（P>0.05），见表2。表1冻精组、对照组患者的普通状况表2冻精组、对照组的ICSI参数和临床结局
3讨论
新颖附睾或睾丸精子行 ICSI被普遍地应用于无精子症患者，使更多的无精子症患者具有了本人的遗传学后代。但是这项技术主要缺陷之一就是每一次ICSI操作都需求外科手术取精，大局部的不孕夫妇仍需行多个取卵和ICSI周期才会受孕，这不只给患者带来费事，还会损伤附睾和睾丸［3］。为理解决这个问题，近些年来，诊断性活检时冷冻附睾或睾丸精子后复苏行ICSI逐步应用于临床，而且获得了与新颖附睾或睾丸精子ICSI周期相近的临床结果［4，5］。我们是2007年7月初探PESA精子冷冻，8月初探TESE精子冷冻，并于2007年9月取得第1例TESE精子冷冻复苏后ICSI的临床妊娠，2007年10月取得第1例PESA精子冷冻复苏后ICSI的临床妊娠。本材料回忆性剖析了诊断性附睾或睾丸活检冷冻精子复苏后行ICSI治疗的有效性及妊娠结局，结果显现冷冻复苏的附睾或睾丸精子行ICSI所得受精率、卵裂率、优质胚胎率、妊娠率和种植率与运用新颖附睾或睾丸精子行ICSI相比没有统计学差别（P＞0.05），这与Gianaroli 等［6］报道分歧。虽然有报道证明［7］，附睾或睾丸精子的冷冻复苏会对精子形成胞浆空泡增加，细胞核和胞质膜皱缩或水肿、膜断裂、顶体等损伤，但冷冻也间接起到了一种挑选的作用，肃清了大局部有缺陷的精子，只要那些活动力较好、膜功用稳定、代谢旺盛、染色体正常的精子才干禁受住低温而得以保全，这种选择，解释了本研讨冻精组临床妊娠率和种植率高于对照组的结果，但本研讨也与一些文献报道相反［8］，思索能否与样本较少有关，还需增大样原本进一步证明。冷冻并没有降低精子的发育潜能，运用冷冻附睾或睾丸精子ICSI的结果是能够承受的。ICSI治疗周期前行诊断性睾丸活检并冻存附睾或睾丸精子是可行和有效的，一方面增加了新颖睾丸组织的应用率，最大限度地保存了患者的遗传物质［9，10］，另一方面也减轻了重复外科手术取精给患者带来的肉体和经济担负，有效地避免了在取卵当日因外科手术取精失败而放弃本周期治疗的发作。
【参考文献】
1Palermo G，Joris H，Devroey P，et al.Pregnancy after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte.Lancet，1992，304:17-18.
2Schoysman R，Vanderzwalmen P，Nijs M，et al.Pregnancy after fertilization with human testicular spermatozoa.Lancet，1993，342:1237.
3Schlegel PN，Su LM.Physiological consequences of testicular sperm extraction.Hum Reprod，1997，12:1688-1692.
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6Gianaroli L，Magli MC，Selman HA，et al.Diagnostic testicular biopsy and cryoproservation of testicular tissue as an alternative to repeated surgical openings in the treatment of azoospermic men.Hum Reprod，1999，14（4）：1034-1038.
7Nogueira D，Bourgain C，Verheyen G，et al.Light and electron microscopic of human testicular spermatozoa and spermatids from frozen and thawed testicular biopsies.Hum Reprod，1999，14（8）:2041-2049.
8Vernaeve V，Tourmaye H，Osmanagaoglu K，et al.Intracytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa is less successfulin men with nonobstructive azoospermia than in men with obstructive azoospermia.Fertil Steril，2003，79：529-533.
9Oates RD，Lobel SM，Harris D，et al.Efficacy of intracytoplasmic sperm injection using intentionally cryopreserved epididymal sperm.Hum Reprod，1996，11:133-138.
10Oates RD，Mulhall J，Burgess C，et al.Fertilization and pregnancy using intentionally cryopreserved testicular tissue as the sperm source for intracytoplasmic sperm injection in 10 men with non azoospermia.Hum Reprod，1997，12:734-739.