食管鳞癌组织芯片中MTA1蛋白表达的免疫组织化学研究

【摘要】  目的 研讨食管鳞癌组织中转移相关基因MTA1蛋白定位及表达程度的改动及与食管鳞癌停顿、转移的关系。办法 应用食管鳞癌组织芯片经过免疫组织化学染色研讨MTA1蛋白在食管癌中的表达状况。结果 MTA1蛋白在食管鳞癌组织中主要定位于胞核，在淋巴结转移灶中呈现胞浆与胞核同时着色。正常组织与重度不典型增生、原位癌及癌组织之间差别有统计学意义，在食管鳞癌不同停顿阶段的组织中MTA1表达逐步升高，并且呈现异位表达。结论 MTA1与食管鳞癌的侵袭和转移高度相关，在食管鳞癌的开展过程中可能发挥着重要作用，可作为判别食管癌侵袭及转移才能的辅助因子。

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【关键词】  食管鳞癌；MTA1；转移；组织芯片

    在肿瘤细胞的生物学特征中，以侵袭性和转移性最为关键，也是恶性肿瘤的最重要标志，因而，对肿瘤转移机制及治疗办法的研讨显得非常迫切。

    MTA1是一个在肿瘤转移过程中表达上调的基因。它是Toh等用差别cDNA文库扫描技术从高转移大鼠乳腺腺癌细胞系中发现的，随后用同源办法发现了人的同源MTA1基因[1]。该基因产物是核小体重塑与脱乙酰基复合体 (nuclear remodeling and deacetylation complex，NuRD)的成分，经过影响染色质的状态来调控基因转录[2]。Toh等研讨还发现，MTA1在食管癌中的表达与其H4组蛋白的脱乙酰基活性相关[3]。经典的抑癌基因如p53、p21和Rb基因都受组蛋白乙酰化的调控[4]。高表达MTA1 mRNA的肿瘤细胞侵袭与淋巴结转移率明显升高。有鉴于此，我们对食管癌中的MTA1蛋白表达停止研讨，肯定MTA1基因在食管鳞癌中表达状况，以及该表达程度与肿瘤临床行为的相关性，为进一步讨论其在食管癌转移过程中的可能分子机制打下根底。

    1  资料与办法

    1.1  抗体

    羊抗人MTA1多克隆抗体（Santa Cruz，sc9446）HRP标志羊抗鼠IgG（北京中山生物公司，ZB2305）

    1.2  食管癌组织芯片临床病理材料

    食管癌组织芯片由中国医学科学院肿瘤医院病文科吕宁教授提供。芯片共包含72例食管鳞癌患者的组织样本，就诊时间为2002～2003年。其中癌旁正常鳞状上皮组织67例，重度不典型增生组织42例，侵袭性癌组织70例，淋巴结转移癌组织20例。

    1.3  免疫组织化学染色步骤

    组织标本石腊包埋切片，常规脱腊至水；0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）停止抗原修复；1∶200稀释一抗，37℃作用1h；生物素标志的二抗IgG，37℃孵育30min；加HRP（辣根酶过氧化物酶）标志的链霉卵白素37℃作用30min；冲洗后DAB显色复染封片。

    1.4  免疫组织化学评分

    1.4.1  MTA1各种组织中的核染色评分规范如文献[5]所述。最终评分范围为0～12分。我们将最终评分8～12定义为强表达，4～8 为中等表达，0～4为弱表达。

    1.4.2  MTA1蛋白的细胞浆染色按以下规范来停止：（a）阳性，组织中细胞浆着色的细胞数≥20%；（b）阴性，组织中上皮细胞或肿瘤细胞的细胞浆着色数<20%。

    1.5  统计学处置

    实验中的数据剖析用SPSS11.0停止剖析。食管癌不同开展阶段组织之间以及不同侵袭水平组织之间MTA1表达差别用方差剖析停止显著性检验。细胞浆与细胞核MTA1阳性率差别用双侧卡方检验停止显著性剖析。P<0.05为差别有统计学意义。

    2  结果

    2.1  不同停顿阶段食管鳞状细胞癌的MTA1的表达程度

    组织芯片染色质量称心，见图1。在正常食管鳞状上皮细胞，MTA1蛋白在细胞核中低表达，而在不典型增生细胞中，MTA1表达程度增高。在侵袭性癌细胞与转移癌细胞中，MTA1阳性细胞数量及染色强度均明显增高。在研讨的样本中，从正常食管鳞状上皮到侵袭癌细胞，MTA1核表达程度随着肿瘤发作阶段的停顿而升高，见图2a～c。 72例正常食管鳞状上皮、不典型增生、侵袭癌和淋巴结转移癌的MTA1表达评分分别为2.93±1.81,6.32±2.72, 8.28±2.43和6.95±2.17。不典型增生细胞、侵袭癌细胞与转移癌细胞细胞中MTA1表达程度均高于食管正常鳞状上皮细胞 (P<0.01)。侵袭癌细胞中MTA1表达程度高于不典型增生细胞，且统计学意义显著 (P<0.01)。转移癌细胞中MTA1核表达程度低于侵袭癌细胞，但统计学意义不显著，见图2c,d。

    2.2  从正常食管鳞状上皮细胞至侵袭癌的进程中，MTA1弱表达的样本比例逐步降低，而MTA1强表达的样本比例逐步升高。但在转移灶肿瘤细胞中的表达主要集中于中等表达程度，见表1，图3。数据剖析中发现MTA1表达程度在不同临床阶段、病理类型的组织中表达差别性不显著，需进一步扩展样本量来停止剖析考证。

    2.4  MTA1在食管鳞癌中的异位表达

    我们留意到食管鳞状细胞癌MTA1蛋白呈现了不同水平的细胞浆表达，以至胞膜表达，见图2e、2f。33%无淋巴结转移的食管鳞癌标本显现了MA1蛋白的胞浆表达(17/50)，而45%的转移癌细胞呈现MTA1胞浆表达(13/20) (0.01<P<0.05)，并且转移癌中胞浆表达的程度要高于侵袭癌细胞。这一结果标明在肿瘤的发作与停顿过程中可能存在着MTA1基因表达的定位异常。< p>

    3  讨论

    应用病理存档的标本停止免疫组织化学染色办法检测肿瘤组织中相关基因蛋白产物能回忆性研讨现有的病例材料，充沛应用病例资源，是肿瘤组织学研讨中不可替代的手腕。组织芯片技术能够将数十个以至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的次第排列在一张玻片停止剖析研讨，能够依照不同的需求设计组织排列，具有高通量、可比性强、节约大量本钱（时间、财力、人力）的优点，而且在同样的条件下停止操作及染色等过程，进步了样本之间蛋白表达程度的可比性，减小了操作的系统误差[6, 7]。应用组织芯片能同时对几百以至上千种正常或疾病以及疾病开展不同阶段的自然病理生理状态下的组织样本，停止某一个或多个特定的基因或与其相关的表达产物的研讨[8]。组织芯片技术能够普遍地与DNA、RNA、蛋白质、抗原、抗体、细胞、传统的病理学技术、免疫组织化学、原位杂交、原位PCR、原位RTPCR等技术相分离，分别在基因、转录和表达产物的生物学功用这三个程度上停止研讨。组织芯片技术目前已成为各医学实验室及生物芯片公司争相研制的抢手技术。

    肿瘤转移形成肿瘤细胞的播散，给肿瘤的手术治疗带来宏大的障碍。因而，深化理解肿瘤转移相关因子的变化可特异反映侵袭转移的才能，不只能够作为判别肿瘤恶性转移的预测指标，并且有助于诊断和采取适宜的治疗手腕。在本研讨中，采用了组织芯片的免疫组织化学研讨肯定MTA1在食管癌组织中的表达状况，拟为食管癌的治疗及预后提供分子程度的参考指标。

    随着食管上皮组织向癌组织的停顿，MTA1蛋白的表达程度升高，依次为侵袭癌组织＞重度不典型增生组织＞癌旁正常组织，差异有统计学意义。标明随着食管鳞癌的发作与开展，MTA1蛋白的表达程度发作了改动。在浸润癌组织中MTA1蛋白具有最高的表达程度，淋巴结组织中的MTA1表达程度固然高于癌旁正常组织及重度不典型增生组织，但低于侵袭癌组织。并且随着肿瘤停顿，在浸润癌及转移癌灶中MTA1蛋白呈现胞浆染色并且有统计学意义。这一现象提示在肿瘤的发作开展过程中MTA1的表达与定位可能发作了紊乱。Moom WS等停止的一项肝细胞癌中MTA1表达的研讨中，也发现了MTA1蛋白的胞浆转移[9]。这一现象的详细机制及功用尚不分明，有待进一步研讨。其他研讨也显现了MTA1在肺癌、肝癌及前列腺癌中与转移的正相关性[911]。随着肿瘤分子生物学研讨的停顿，MTA1在肿瘤侵袭转移过程中发挥的作用将被进一步提醒。

【参考文献】
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