5-脂氧合酶及诱导型一氧化氮合酶在星形细胞瘤中的表达及其相关性研究

　【摘要】 目的:研究5-脂氧合酶(5-LOX)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在星形细胞瘤中的表达特点及相关性。方法:60例星形细胞瘤，免疫组织化学法检测5-LOX和iNOS的表达，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测二者的mRNA水平,14例非肿瘤脑组织作为对照组。结果:对照组5-LOX和iNOS不表达或低表达，星形细胞瘤高度恶性组5-LOX和iNOS的阳性表达率及mRNA含量均高于低度恶性组(P<0.01)，二者呈正相关(γ=0.525，γ=0.431，P<0.01)。结论:5-LOX和iNOS的表达与星形细胞瘤恶性程度有关,二者在星形细胞瘤发生发展过程中有协同作用。 

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　　【关键词】 星形细胞瘤;5-脂氧合酶;诱导型一氧化氮合酶

　　Expression of 5-lipoxygenase and Iducible Nitric Oxide Synthase in Astrocytoma and Their RelationshipEI Jun-rong,QIN Jun*，ZHANG Jing,ZHANG Li,LUO Jie,TU Han-jun (Department of Neurosurgery,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract: Objective To study the expression of 5-lipoxygenase(5-LOX)and iducible nitric oxide synthase(iNOS)in astrocytoma and their relationship.Methods The expression of 5-LOX and iNOS were detected by immunohistochemistry in 60 cases of astrocytoma tissues,the mRNA level of 5-LOX and iNOS were detected with RT-polymerase chain reaction(RT-PCR),and another 14 cases of normal tissues were selected as controls.Results The expressions of 5-LOX and iNOS in normal controls were negative or low level.The positive rates of 5-LOX and iNOS expression were significantly higher in highly malignant group than that of lower malignant group(P<0.01),and the expressions of 5-LOX and iNOS were positively correlated with the malignant degree(γ=0.525,γ=0.431,P<0.01).Conclusion The expressions of 5-LOX and iNOS may be related to the malignant degree of astrocytoma,and they may coordinate with each other in the progression of astrocytoma.

　　Key words：Astrocytoma;5-lipoxygenase;Iducible nitric oxide synthase

　　诱导型一氧化氮合酶(iducible nitric oxide synthase，iNOS)在肿瘤中被激活表达，广泛参与肿瘤血管生成，肿瘤细胞增殖与凋亡等过程。5-脂氧合酶(five-lipoxygenase,5-LOX)是5-LOX途径中催化花生四烯酸(arachidonic acid,AA)转化为白三烯和氢氧化物的关键酶，研究发现[1]，5-LOX在多种肿瘤中高表达，发挥和iNOS类似的作用，与肿瘤的发生与发展密切相关。本实验研究5-LOX和iNOS在星形细胞瘤中的表达情况,探讨两者的相关性及其在星形细胞瘤发生和发展中的作用。

　　1 资料和方法

　　1.1 试剂和仪器兔抗人5-LOX多克隆抗体及iNOS多克隆抗体及羊抗兔免疫组化试剂盒购自晶美公司;Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒及TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司，引物由上海鼎安生物科技公司合成;凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司产品。

　　1.2 一般资料收集郧阳医学院附属太和医院神经外科2007年3月-2008年6月60例星形细胞瘤标本。其中男34例,女26例,年龄8~71岁,平均(46.34±19.78)岁。参照2000年WHO关于神经系统肿瘤分级标准[2]，分为低度恶性组33例(Ⅰ~Ⅱ级),高度恶性组27例(Ⅲ~Ⅳ级)。另取14例脑外伤行减压术患者非肿瘤脑组织为对照组(受伤至取标本时间小于6 h)。所有标本均一部分经10 %福尔马林固定，石蜡包埋,4 μm 厚连续切片,行免疫组化染色，另一部分存于液氮中,备行RT-PCR实验。

　　1.3 免疫组化染色方法严格按免疫组化SP法进行操作，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照,以乳腺癌标本为阳性对照。随机选择10个高倍视野记录1 000个细胞,按照下述方法进行评分。阳性细胞百分比：无表达为0，<25%为1，25%~50%为2，>50%为3;着色强度：无着色为0，弱(淡黄色)为1，中(棕黄色)为2，强(棕褐色)为3,以两者分值相加为最后得分:0分为阴性(-),2分为 (+),3~4分为 (++),5~6分为 (+++)。

　　1.4 逆转录聚合酶链反应严格按Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定OD260/OD280在1.8~2.0之间;逆转录获得cDNA第一链;用相关引物扩增得到目的片断。引物序列及反应条件如下：5-LOX，sense：5′-ATCAGGACGTTCACGGCCGAGG-3′,antisense：5′-CCAGGAACAGCTCGTTTTCCTG-3′，退火温度60℃，循环次数35次，扩增产物长度412 bp;iNOS，sense：5′-GAGAAAGCCCCCTGTGCC-3′,antisense：5′-TACCGCTTCCACCCTGGC-3′，退火温度57 ℃，循环次数35次，扩增产物长度424 bp;β-actin，sense 5′-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3′, antisense:5′-GAT CTT CAT GAG GTA GTC AG-3′,扩增产物长度234 bp。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上扫描，测目标片段和β-actin的电泳条带灰度积分，以二者比值代表目标基因的相对表达含量。

　　1.5 统计学分析统计处理由SPSS 13.0软件包完成，免疫组化结果采用χ2检验和Spearman相关分析，RT-PCR数据采用F检验和Pearson相关分析，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫组化染色结果5-LOX和iNOS在对照组中均不表达或低表达。5-LOX的表达定位于胞浆和核膜上，为棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，高度恶性组5-LOX的阳性表达率显著高于低度恶性组(图1，表1)。iNOS的表达定位于胞浆,为棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，高度恶性组iNOS的阳性表达率显著高于低度恶性组(图2，表1)。5-LOX和iNOS在星形细胞瘤中的表达呈正相关(γ=0.525，P<0.01)。

　　表1 各组5-LOX及iNOS免疫组化染色检测结果(略)

　　注：与对照组比较，*P<0.01;与低度恶性组比较，△P>0.05

　　2.2 RT-PCR结果星形细胞瘤中5-LOX mRNA含量高于对照组，高度恶性组5-LOX mRNA含量高于低度恶性组(图3，表2)。星形细胞瘤中的iNOS mRNA含量高于对照组，高度恶性组iNOS mRNA含量高于低度恶性组(图4，表2)。5-LOX和iNOS在星形细胞瘤中的mRNA水平呈正相关(γ=0.431，P<0.01)。

　　表2 各组RT-PCR检测mRNA水平的比较(略)

　　注：与对照组比较，*P<0.01;与低度恶性组比较，△P>0.05

　　图3 5-LOX mRNA水平(略)

　　1：低度恶性组;2：高度恶性组;3：对照组

　　图4 iNOS mRNA水平(略)

　　1：低度恶性组;2：高度恶性组;3：对照组

　　3 讨论

　　环氧合酶(cyclooxygenasa，COX)通路和LOX通路是AA的两条主要代谢途径，早期的研究主要针对COX通路，发现COX通路和恶性肿瘤的发病有关。近年的研究发现LOX通路，尤其是5-LOX通路在恶性肿瘤的形成过程中可能起着更为重要的作用。目前，5-LOX的研究主要集中于消化系统肿瘤，但在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤等其它系统肿瘤中的研究也日渐增多。研究显示5-LOX在肿瘤中表达上调，与肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖与凋亡等有关[1]。一氧化氮合酶目前发现有3类，nNOS和eNOS在维持神经细胞的效应传递功能和血管的舒缩功能，保证血管扩张、血液供应上起重要作用;iNOS在肿瘤中可以被激活表达，其作用十分广泛，在肿瘤发生与发展的多个过程中起着重要作用[3]。

　　Nathoo N[4]报道，在高度恶性星形细胞瘤中5-LOX mRNA及蛋白表达明显升高，在49例胶质母细胞瘤标本中5-LOX的表达为90%(44/49)，而在低度恶性星形细胞瘤中仅为23%(3/13)。国内Zhang L[5]发现5-LOX不仅在脑损伤组织中表达增高，而且也在胶质瘤中高表达。本组研究亦表明，5-LOX在对照组中不表达或低表达，在星形细胞瘤中表达明显增高，且高度恶性组的表达高于低度恶性组。关于iNOS在胶质瘤中的研究较多，多数学者认为iNOS在胶质瘤中高表达，且与胶质瘤病理分级成正相关[6]，本组研究亦支持此观点。5-LOX与iNOS共同参与了胶质瘤的发生与发展，其促肿瘤机制涉及肿瘤血管形成及肿瘤细胞增殖与凋亡等过程。实验提示肿瘤中一定量NO的产生可增加肿瘤血流量并促进血管新生，进而促进肿瘤生长;iNOS不仅通过产物NO和VEGF相互作用发挥其促血管生成作用，也可与VEGF受体结合来调节血流量促进肿瘤生长和转移[7-8]。5-LOX亦有一定的促进血管形成作用。5-LOX及其代谢产物5-HETE可以通过活化PI3K/AKT级联反应促进微血管内皮细胞DNA合成。而且，5-LOX的同工酶12-LOX也具有显著的促血管形成作用。除了广泛参与肿瘤的血管形成外，5-LOX及iNOS还与肿瘤细胞的增殖与凋亡有关。研究表明[7]，iNOS可以通过参与肿瘤新生血管生成以及扩张血管等途径促进肿瘤细胞增殖，同时，iNOS也与肿瘤细胞的凋亡密切相关。iNOS的产物NO既能诱导凋亡，又能抑制凋亡,其具体机制仍不十分清楚，有学者认为与肿瘤组织局部的NO浓度、肿瘤类别等有关[9]。研究显示[10-11]，5-LOX可以通过调控MEK/ERK途径、PI3K/AKT途径以及下调促凋亡蛋白/抗凋亡蛋白比值等发挥促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡的作用。

　　本组研究还发现，5-LOX及iNOS表达水平与星形细胞瘤病理分级有关，且5-LOX与iNOS在星形细胞瘤中的表达成正相关，提示5-LOX与iNOS可能具有协同作用，共同参与了星形细胞瘤的血管生成、肿瘤细胞增殖与凋亡等过程。但是，它们之间的上下游关系以及分子调控机制目前仍知之甚少。许多研究已经表明，核因子-κB(NF-κB)是iNOS的上游调节因子。Manu Jatana[6]等发现，5-LOX的特异性抑制剂之所以对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其重要机制之一是其可以通过抑制NF-κB的活化而抑制iNOS的表达及活性。这就是说，在大鼠脑缺血再灌注损伤模型中，5-LOX很可能是通过NF-κB的活化而调控下游iNOS的表达及活性。另外，也有研究提示5-LOX可能通过PI3K/AKT途径抑制IκB(核因子-κB的抑制单位), 启动NF-κB转录功能,进而调节下游iNOS等的表达[7]。但是，在星形细胞瘤中是否也存在相似的调节途径，5-LOX与iNOS是否还有其它的调节方式及它们与其它因子的关系，需要进一步研究证实。

　　(文中图1~2见封三)(略)

　　【参考文献】

　　1] Pidgeon GP,Lysaght J,Krishnamoorthy S,et al.Lipoxygenase metabolism:roles in tumor progression and survival[J].Cancer Metastasis Rev,2007，26(3-4):503-524.

　　[2] Radner H,Blümcke I,Reifenberger G,et al.The new WHO classification of tumors of the nervous system 2000.Pathology and genetics[J]. Pathologe,2002,23(4):260- 283.

　　[3] 雷军荣，石松生，杨卫忠.诱导型一氧化氮合酶与胶质瘤[J].郧阳医学院学报,2008,27(2):183-185.

　　[4] Nathoo N,Prayson RA,Bondar J，et al.Increased expression of 5-lipoxygenase in high-grade astrocytomas[J].Neurosurgery,2006,58(2):347-354.

　　[5] Zhang L,Zhang WP,Hu H，et al.Expression patterns of 5-lipoxygenase in human brain with traumatic injury and astrocytoma[J].Neuropathology,2006,26(2):99-106.

　　[6] Broholm H,Rubin I,Kruse A,et al.Nitric oxide synthase expression and enzymatic activity in human brain tumors[J].Clin Neuropathol,2003，22(6):273-281.

　　[7] Niu XJ,Wang ZR,Wu SL,et al.Relationship between inducible nitric oxide synthase expression and angiogenesis in primary gallbladder carcinoma tissue[J].World J Gastroenterol,2004,10(5):725-728.

　　[8] Thirunavukkarasu M,Juhasz B,Zhan L，et al.VEGFR1 (Flt-1+/-) gene knockout leads to the disruption of VEGF-mediated signaling through the nitric oxide/heme oxygenase pathway in ischemic preconditioned myocardium.[J].Free Radic Biol Med,2007,42(10):1 487-1 495.

　　[9]Ziche M,Morbidelli L,Choudhuri R,et al.Nitric oxide sythase lies downstream from vascular endothelial growth factor-induced but not basic fibroblast growth factor induced angiogenesis[J].J Clin Invest,2001,107(18)：945-946.