CD4+CD25+调节性T细胞在肝移植术后腹腔感染中的表达及其作用

【摘要】  目的 研讨移植后细菌感染CD4+CD25+调理性T细胞(Treg)表达的变化。办法 以DA大鼠为供体，LEW大鼠为受体，采用改进的Kamada二袖套法树立肝移植模型。术后随机分为3组，G1组术后3 d腹腔生理盐水注射；G2组术后3 d给予腹腔大肠杆菌注射；G3组术后常规给予免疫抑止药物CsA，3 mg/(kg·d)。感染后7 d处死动物，每组6个样本，检测血清ALT、TB，并采用流式细胞术检测脾脏Treg的程度，RTPCR办法检测脾脏Foxp3和肝脏IL10、TGFβ mRNA的表达。结果 G3、G2组Treg表达程度显著升高，分别为：(16.72±0.95)%，(27.4±1.09)%，与G1(9.88±0.98)%比拟差别均有统计学意义(P＜0.01)；脾脏Foxp3和肝脏IL10、TGFβ mRNA表达程度均增加；感染组的肝功固然较差，与排挤组相比无统计学意义，但从病理切片察看该组肝脏的急性免疫排挤反响减轻，Banff评分有统计学意义。结论 大鼠肝移植术后腹腔细菌感染增加了脾脏Treg的表达，促进了免疫抑止作用的发挥，局部减轻了急性排挤反响。

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【关键词】  肝移植； 腹腔感染； CD4+CD25+调理性T细胞； 急性排挤反响

     Expression and effect of CD4+CD25+ regulatory T cells in model of abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats  DING Long*, YANG Yu, DONG Jiahong. *Southwest Hospital & Institute of Hepatobiliary Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    Corresponding author: DONG Jiahong, Email: dongjh@301hospital.com.cn

    【Abstract】  Objective  To investigate expression of CD4+CD25+ regulatory T cells in model of abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats. Methods  Orthotopic liver transplant (OLT, DA to Lewis) models were established by modified Kamada twocuff technique. All rats were randomly divided into 3 groups after operation. Normal saline was injected into abdominal cavity at 3rd day postoperatively in group 1, mixed Bacillus coli liquid in group 2 and CsA at 3 mg/kg per day in group 3. Six recipients were sacrificed 7 days after infection in each group, blood and graft samples were collected for detection of ALT and TB. The levels of Treg and Foxp3 in spleens and IL10, TGFβ mRNA in livers were detected by flow cytometry and RTPCR, respectively. Results  Compared with the level of Treg for 9.88±0.98 in group 1, the levels of Treg increased obviously in groups 2 and 3 (16.72±0.95 vs 27.4±1.09), with statistical difference (P<0.01), so do the expressions of Foxp3, IL10 and TGFβ mRNA. Although the serum concentrations of AST and TB 7 d in Group 2 was higher than those in Group 1, the Banff scores of grafts in group 2 were lower than those in group 1  (P<0.05). Conclusions  Abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats increase expression of Treg, promote the immunosuppressive action and partially alleviate the acute rejection.

    【Key words】  Liver transplantation;   Abdominal cavity bacterial infection;   CD4+CD25+ regulatory T cells;   Acute rejection

    肝移植已成为终末期肝病及急性肝功用衰竭的有效治疗办法，但是术后创伤及大量激素和免疫抑止药物的应用又会增加细菌、病毒、真菌的感染，这也是肝移植术后惹起死亡的常见缘由之一［1-2］。在重症感染机遇体的免疫系统在阅历免疫激活后会进入免疫抑止状态，以避免组织器官的过度病理损伤， 其中CD4+CD25+免疫抑止性细胞发挥了重要作用［3］。移植后由于创伤及免疫抑止药物的应用，机体处于免疫受损状态，此时兼并细菌感染的机体免疫状态会发作怎样的变化，CD4+CD25+调理性T细胞(Treg)表达程度如何，对肝功及免疫排挤会有怎样的影响?本研讨旨在探明上述问题。

    1  资料与办法

    1.1  资料

    成年雄性近交系DA大鼠(体质量200 g左右)为供体，购于哈尔滨医科大学动物中心。以成年雄性近交系Lewis大鼠(体质量200～220 g)为受体，购于北京维通利华实验动物有限公司。顺应性饲养于西南医院肝胆科实验中心动物室。供受体术前12 h禁食，不由水，术后自主食水。主要试剂：流式单克隆抗体购自Biolegend公司，包括PE antirat CD4(W3/25，IgG1)；FITC antirat CD25(OX39，IgG1)，EZSepTM Mouse IX淋巴细胞别离液购自达科为生物技术有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver 3.0试剂盒购自宝生物工程有限公司。

    1.2  办法

    1.2.1  动物模型的树立：本实验采用改进的Kamada二袖套法［4］，无需静脉分流，树立大鼠肝移植模型。随机分为(1)免疫排挤组(G1)：大鼠肝移植术后3 d腹腔内生理盐水注射；(2)移植术后感染组(G2)：于移植术后3 d腹腔内大肠杆菌注射，注射量为5×105 CFU/ml；(3)免疫抑止组(G3)：移植术后CsA肌注，注射量3 mg/(kg·d)。感染后7 d每组随机处死动物6只，取血及肝脏、脾脏，备相应指标及病理学检测。

    1.2.2  检测指标及实验办法

    (1)脾脏CD4+CD25+细胞亚群检测：处死大鼠，无菌取脾，用EZSepTM Mouse IX淋巴细胞别离液别离出淋巴细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106/ml。取上述淋巴细胞混悬液50 μl，参加标有荧光素的单克隆抗体工作液50 μl(每种抗体各25 μl)；37 ℃水浴30 min，避光；参加PBS 10 m1，混匀；1 000 r/min离心10 min；反复离心1次；参加1 ml PBS缓冲液混匀；上机检测。

    (2)脾脏Foxp3 mRNA的表达：用Trizol液提取100 mg脾组织mRNA，分光光度法测定RNA的纯度，采用RTPCR技术，以G3PDH为内参，引物序列Foxp3：Sense 5′CCCAGGAAAGACAGCAACCTT3′，Antisense 5′CTGCTTGGCAGTGCTTGAGAA3′，扩增产物片段长度为619 bp；G3PDH：Sense 5′GCATGGCCTTCCGTGTTCCTAC3′，Antisense 5′ACTCCTTGGAGGCCATGTAGGC3′，扩增产物片段长度为318 bp。PCR反响参数：预变性94 ℃ 5 min，PCR反响94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环，延伸72 ℃ 10 min。用凝胶成像系统照相，Bandscan软件停止图像剖析，结果以目的区带的光密度值积分/内参区带的光密度值积分表示，作为目的mRNA的相对含量，停止半定量剖析。

    (3)肝脏内IL10、TGFβ mRNA的表达：RNA提取同上述，仍以G3PDH为内参。引物序列IL10：Sense 5′GCTGACAGATTCCTTACTGCAGG3′，Antisense 5′ACGTAGGCTTCTATGCAGTTGATG3′，片段长度为321 bp；TGFβ： Sense 5′CACCTGCACAGCTCCAGGCAC3′，Antisense 5′CTTGCGACCCACGTAGTAGACG3′，片段长度312 bp，反响条件：退火温度分别为61、62 ℃。PCR产物在1.5%的琼脂凝胶上电泳，用BandScan软件计算扩增条带灰度值。

    (4)血清ALT、TB表达程度：经腹主动脉取血2 ml，别离血清，用Beckman全自动生化剖析仪检测血中谷氨酸氨基转移酶(ALT)和总胆红素(TB)的程度。

    1.3  统计学剖析

    统计用SAS软件计算，组间比拟采用t检验，各组病理学急性排挤反响Banff评分的比拟采用秩和检验。

    2  结果

    2.1  脾脏Treg的增殖变化

    各组的Treg均有不同水平的表达，G1=(9.88±0.98)%，G2=(27.4±1.09)%，G3=(16.72±0.95)%，各组间比拟差别均有统计学意义(P＜0.01，G2与G1、G3相比P值分别为0.000 0和0.000 3)。

    2.2  脾脏Foxp3 mRNA的表达

    各组脾脏内Foxp3 mRNA程度均有不同水平的表达，G1：(0.559±0.06)%，G2：(0.963±0.11)%，G3：(0.781±0.09)%，G2与G1组相比差别有统计学意义(P=0.001 1＜0.01)；与G3相比差别有统计学意义(P=0.031＜0.05)，见图1。

    1～3：G1～G3

    图1  脾内Foxp3 mRNA的表达程度

    2.3  肝脏内IL10、TGFβ mRNA的表达

    各组IL10和TGFβ mRNA程度均有不同水平的表达，IL10的程度在G2表达程度最高，与G1、G3相比差别均有统计学意义，而TGFβmRNA的程度在G3组表达最为显著，G2次之，各组间比拟差别仍有统计学意义，见表1、图2、3。 表1  各组肝内IL10和TGFβ的表达程度

　　2.4  肝功用检查 G3组大鼠肝移植术后ALT、TB有轻度增高，G1、G2组两种指标显著升高，两组相比差别无统计学意义，与G3相比差别有统计意义(P=0.000 0)。见表2。表2  各组肝功用变化比拟

    2.5  肝脏病理改动

    移植感染后可见汇管区有淋巴细胞浸润，肝小叶构造不清，中央静脉扩张，充血，仅有少量淋巴细胞浸润，与免疫抑止组表现类似，但肝细胞毁坏更明显；和免疫排挤组相比，后者汇管区和中央静脉大量淋巴细胞浸润，累及四周肝本质，胆管炎症明显，胆管细胞含糊、胞质空泡构成，极性紊乱，以至消逝(图4～9)。各组病理学Banff评分［5］见表3。表3  各组移植后7 d的移植物病理切片的排挤反响Banff评分的比拟图4  移植感染后可见汇管区淋巴细胞浸润，胆管细胞空泡，排列较划一  (HE  ×200)    图5  移植后感染后可见中央静脉充血，变形，无明显淋巴细胞浸润  (HE  ×200)    图6  免疫排挤组，汇管区大量淋巴细胞浸润，胆管细胞空泡化，极性消逝，数量减少  (HE  ×200)    图7  免疫排挤组，中央静脉变形，有较多淋巴细胞浸润  (HE  ×200)    图8  应用免疫抑止药物后，中央静脉扩张，有少量淋巴细胞浸润  (HE  ×200)    图9  应用免疫抑止药物后，汇管区有淋巴细胞浸润，胆管细胞排列较划一

    3  讨论

    CD4+CD25+T细胞是一组能表达IL2Rα链及多种外表分子的CD4+ T细胞亚群，大约占安康小鼠及人外周血CD4+ T细胞总数的5%～15%，可以从外周血、胸腺及次级淋巴器官中别离得到。Treg在感染、肿瘤、器官移植免疫耐受中均发挥着重要的作用，重症腹腔感染时Treg的表达程度增加［3，6］。在感染免疫中，调理性T细胞最主要的功用就是调理有效控制病原体的T细胞反响和招致严重组织毁坏的过度T细胞反响之间的均衡。Treg的作用能够减轻炎症反响及免疫病理损伤，但随着对病原体控制才能的降落招致感染的长期存在或加重。

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    本研讨经过树立DA到LEW的肝移植排挤模型，在此根底上给予腹腔大肠杆菌注射作为研讨模型，察看感染与排挤的关系。从研讨结果中我们察看到，感染后7 d，肝移植后感染大鼠脾脏内Treg呈高程度表达，与免疫排挤组相比，数量增加了近乎1倍，Treg能如此高程度的表达剖析缘由可能有以下几点：(1)发作活化增殖的Treg对四周环境中的淋巴细胞或抗原递呈细胞分泌的IL2具有高度的敏理性，而且Treg外表具有普遍的Toll样受体(toll like receptor,TLR)，包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8，因而它可以辨认激进病原体产物，特别在有IL2的作用下(移植术后由效应T细胞分泌的)，能增强其增殖、活化，并扩展抑止功用［7］；(2)肝移植术自身反响性增加的趋化因子如：CCL1、CCL17、CCL22和CCL4、TRANCERANK也能吸收Treg向炎症部位汇集［8］；(3)Treg一旦经TCR活化，则后续的效应活化可是抗原非特异性，这种特性即便得Treg在短时间内大量的扩增表达［9］。

    增加表达的Treg能否能正常发挥抑止效应?Foxp3基因表达在活的Treg上，是该细胞的特异性表达基因，决议着Treg的抑止功用的发挥。本研讨中Foxp3基因表达的上升同时提示了增殖的Treg有可能正常发挥的抑止作用。我们在此根底上又进一步检测了肝脏内IL10、TGFβ mRNA的表达，活化的Treg在体内分泌这两种细胞因子而发挥抑止作用的，上述的研讨结果保证了活化增殖的Treg的抑止作用的发挥。这一结果在肝病理排挤诊断上也得到了证明。

    在我们的研讨结果中察看到，固然肝移植排挤反响有所缓解，但肝功用并无明显改善，剖析缘由：(1)固然Treg具有免疫抑止作用，但在感染早期Treg的活化增殖尚未完成；(2)病原体成分形成的肝细胞的损伤，另外Treg抑止了免疫效应也使得病原成分在体内的长期存活；(3)免疫排挤尚不能被完整抑止，移植肝脏遭到双重免疫损伤。

    在大手术、器官移植的患者由于免疫反响的抑止，感染更具有了临床表现特殊性：感染发作率高、病原体品种多、表现不典型、易播散、病情凶险、病情停顿快，病死率高等特性。机体免疫系统为避免这种复杂的变化对组织器官产生过度的病理损伤，经过各种方式启动免疫抑止机制，除了与上述的Treg表达、IL10分泌增加有关外，还可能存在T细胞凋亡增加等多种要素［10-11］。进一步探明这种免疫抑止的变化机理及变化趋向将为我们的临床治疗提供良好的自创与指导，使感染期间免疫抑止剂得到更合理的应用，进步患者的生存率与延长移植物的生存期。

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