GABAB受体对位听神经脑干传入通路神经活动的影响

【摘要】  目的　本实验旨在讨论GABA能神经递质及GABAB受体对电刺激位听神经传入脑干通路兴奋性变化的影响。办法　运用出生后0 ～ 5 d的ddy/ddy小鼠制备脑干切片。脑片经电压敏感染料NK3041染色，电刺激与脑片相连的位听神经残端，运用16 × 16像素的硅光电二极管阵列丈量膜电位变化惹起的电压敏感染料吸光度的改动。察看GABA及GABAB受体拮抗剂2-Hydroxysaclofen（saclofen）对神经活动的影响，运用ARGUS-50/PDA软件剖析实验数据。结果　多部位的光学记载办法显现了从位听神经到耳蜗核和前庭核兴奋性传导的时间-空间散布。神经活动可用电位或颜色的改动显现。每一个像素记载的电信号由快的峰电位样反响和慢反响组成。抑止性神经递质GABA可降低快的峰电位样反响及慢反响的幅度；GABAB受体拮抗剂saclofen可以局部逆转GABA的作用，随着saclofen（50 ?滋mol/L ～ 100 ?滋mol/L）的浓度增加，在耳蜗核及小脑可惹起去极化电位加强及后超极化电位。结论　电刺激位听神经在脑干传入通路可惹起兴奋性神经活动，GABA及saclofen对诱发的神经活动有调理作用，提示GABA及GABAB受体在听觉传入通路和小脑担负重要的生理功用。

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【关键词】  光学记载；　GABA；　GABAB 受体；　脑干切片

    　 Influences of GABAB receptors on the neuronal activities of afferent impulses along the vestibulocochlear nerve brainstem pathway

    Cai Shu-ping1,  YANG Shi-ming2,  FANG Zheng-yu1,  GENG Miao1,  Doi T3

    1　Institute of Geriatrics, PLA General Hospital, Beijing　100853, China

    2　Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, PLA General Hospital, Beijing 100853, China

    3　Department of Otolaryngology， Kansai Medical University, Osaka, Japan 570

    　　【Abstract】 Objective　To explore the influences of GABA ergic neurotransmitter and GABAB receptors on the excitatory changes from the vestibulocochlear nerve afferent brainstem pathway evoked by electro-stimulation. Methods  Brainstem  slices were prepared using ddy/ddy mice of postnatal 0 - 5th days. The brainstem slices were stained with voltage-sensitive dye NK3041.  The cut end of the vestibulocochlear nerve（nⅧ） was stimulated by an electrical pulse through a tungsten electrode; a 16 × 16 pixels silicon photodiode array was used to record the absorbency changes of voltage-sensitive dye induced by depolarization of membrane potentials from auditory brainstem slices. On the neuronal activities, the influences of GABA and an antagonist against GABAB receptors， 2-hydroxysaclofen（saclofen） were observed. The experimental data were analyzed by ARGUS-50/PDA software. Results　The spatio-temporal distribution of excitatory propagations from the vestibulocochlear nerve to cochlear nucleus and vestibular nucleus was recorded with a multiple-sites optical recording system. The neuronal avtivities were displayed with changes of electrical potentials or colors. The electrical signals consisted of a fast spike-like response and a following slow response from each pixel. Inhibitory neurotransmitter GABA could decrease the both amplitudes of fast spike-like responses and following slow responses, whereas the saclofen reversed the effects of GABA partially. As the concentration increased（50 ?滋mol/L ～ 100 ?滋mol/L）， saclofen induced a reinforced fast spike-like response and a after-hyperpolarization response which followed the fast spike-like response in the cochlear nucleus and cerebellum. Conclusion The excitatory neuronal avtivities were recorded along the brainstem afferent pathway evoked by electro-stimulation to the cut end of the vestibulocochlear nerve. GABA and saclofen，an antagonist against GABAB receptors modulated the evoked neuronal activities. The present experiment suggests that GABA and saclofen play important physiological roles in the auditory afferent pathway and cerebellum.

    　　【Key words】　Optical recording;　GABA;　GABAB receptor;　Brainstem slices

    　　电生理学的研讨关于理解中枢神经系统的构造及功用是十分重要的。过去20年间，采用电压敏感染料作为介质的多部位光学记载技术在颅神经的传入激动及神经递质受体研讨方面获得了显著的进步［1-6］。Momose-Sato 察看了鸡胚脑干迷出神经和三叉神经以及听神经刺激诱发的动作电位的发作和早期发育过程，并显现了谷氨酸、?酌-氨基丁酸、甘氨酸等受体冲动剂、拮抗剂对电位变化的影    响［4－6］。Yang［7－11］和Cai［12］等运用光学记载的办法描绘了在出生后早期小鼠脑干切片中，刺激听神经诱发的耳蜗核（cochlear nucleus，CN）和前庭复核（vestibular nucleus complex，VNC）的电位变化，并且证明了NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸）是重生小鼠听觉传入的主要兴奋性递质，甘氨酸和 ?酌-氨基丁酸受体对听神经刺激诱发的兴奋性传入有调理作用。

    　　免疫细胞化学与超微构造研讨显现，GABA　（?酌-氨基丁酸）受体在听觉传导路中普遍散布［13-16］。GABAA受体对刺激位听神经诱发的脑干兴奋性传导的作用已有报告［12］，而GABAB受体的作用尚 未得到论述。本实验旨在讨论听觉脑干切片中GABAB受体对电刺激位听神经传入激动的影响。

    1　资料和办法

    1.1　动物实验　运用出生后0 ～ 5 d的ddy/ddy小鼠制造听觉脑干切片。办法如下：将动物置于 － 20 ℃ 冰箱中3 min冷冻麻醉，断头处死，全脑置于冰浴的人工脑脊液（Artificial Cerebrospinal Fluid，ACSF）中，ACSF成分如下（mmol/L）: NaCl 124，KCl 5，KH2PO4 1.2，MgSO4 1.3，CaCl2 2.4，NaHCO3 26.0，D-glucose 10.0，以5% CO2 / 95%O2混合气均衡至pH 7.4。持续给气，在倒置显微镜下停止大脑别离手术，将脑干从全脑别离后，于第 Ⅷ 颅神经根程度横断脑干，制成厚度约1 mm的脑片，脑片包括一侧无损伤的第 Ⅷ 颅神经残根。脑干切片的解剖根底参考Swanson氏图谱［17］。将脑片置于硅胶铺底的有机玻璃平皿中，用直径    30 ?滋m钨丝固定。

    1.2　电压敏感染料　电压敏感染料NK3041（Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho，Okayama，日本）用 ACSF配成0.2 mg/ml浓度，将脑片在32℃ 温箱中染色20 - 30 min。用无染料的ACSF洗去未分离的染料，停止光学记载前在32℃ 温箱中孵育1   小时。

    1.3　光学记载　实验用钨丝电极（A-M system,Inc.，美国）刺激与脑片衔接的第Ⅷ颅神经残端, 刺激条件：正相矩形波脉冲，电流强度5 mA，持续时间5 ms, 0.1 Hz。将固定脑片的平皿置于显微镜(TMD-3，Nikon，日本)的载物台上,由100W的钨-卤素灯提供光源。运用16 × 16像素的硅光电二极管阵列（Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，日本）丈量光学信号。在396 ms的记载时间内，采样396个，每个采样点叠加2次，最小剖析时间0.5 ms。所得到的数据贮存在计算机中，运用ARGUS-50/PDA软件剖析数据。光学信号以光吸收的变化表示（△I/I），I代表透过标本的光强度，△I代表当神经活动被诱发光阴强度的改动。NK3041染料在702 nm 的滤镜下可得到最大的光学信号，在607.5 nm的滤镜下，光学信号最小或位相反转。本实验一切数据在702 nm滤镜下取得，每一次实验用607.5nm滤镜检测光学信号的逆转效应。一切数据经16次扫描后均匀处置，一切实验在室温下操作（24℃ ～ 26℃）。

    1.4　实验试剂　?酌 - 氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA），荷包牡丹碱（Bicuculline methiodide，BMI）， 2-hydroxysaclofen（saclofen）购自Sigma公司（St Louis， MO， 美国）

    1.5　统计学处置　丈量后超极化电位（AHP）的起始时间（耳蜗核： n = 35 pixels；小脑： n = 16 pixels）， 终止时间（耳蜗核： n = 30 pixels； 小脑： n = 15 pixels）， 持续时间（耳蜗核： n  =  30 pixels； 小脑： n = 15 pixels） 以及电位幅度（耳蜗核： n = 35 pixels； 小脑： n = 16 pixels）， 所得结果以均匀数 ± 规范差（x ± s）表示。

    2　结　果

    2.1　位听神经诱发的脑干光学信号　图1a显现了光学记载系统与脑片堆叠的相对位置以及神经兴奋性变化的时-空散布，去极化电位主要散布在刺激同侧脑干切片的耳蜗核（CN）、前庭复核（VNC）部位。电位变化也能够颜色改动显现，图1b用不同颜色表示去极化过程中盘绕着CN和VNC的等电位图。

    　　诱发电活动有2个主要成分：一个快的峰电位样反响，后随一个较长持续期的慢电位。快的峰电位样反响含有2个时相：第1个时相表现了突触前电位的特征：电位在无钙的ACSF中不受影响，可被河豚毒（TTX）取消；快的峰电位样反响的第二相和慢信号均具有突触后电位的特征：当用无钙ACSF替代正常ACSF 10 ～ 20 min后，快反响的　第二相和慢反响的幅度被抑止。慢反响信号具有　较长的埋伏期，提示这个信号很可能经过多突触　　传送［12］。

    2.2　GABA及GABAB受体拮抗剂的作用及后超极化现象    Saclofen是竞争性GABAB受体拮抗剂，ACSF浸液中单独参加saclofen可使快的峰电位样反响的幅度明显增高。我们配制了从2 ?滋mol/L到200 ?滋mol/L的浓度梯度试液，察看不同浓度的saclofen对诱发神经信号的影响（n = 3 slices）。浓度-反响曲线见图2。实验发现2 ?滋mol/L浓度的saclofen  可极大增高去极化电位的幅度，随着浓度增加     （4 ?滋mol/L ～ 50 ?滋mol/L），去极化电位的幅度没有增加，反而降低；在100 ?滋mol/L saclofen作用下，在脑片的背侧耳蜗核（Dorsal cochlear nucleus，DCN）表层，快的峰电位样反响再次加强并到达最大幅度，并在快反响后呈现明显后超极化电位（After hyperpolarization，AHP）。

    　　在另一组实验中（n = 8 slices），浸液中依次运用50 ?滋mol/L GABA，20 min；50 ?滋mol/L GABA +200 ?滋mol/L BMI，20 min；50 ?滋mol/L GABA + 200 ?滋mol/L BMI + 200 ?滋mol/L saclofen，20min；在每一种条件下丈量诱发电位的改动。实验发现50 ?滋mol/L GABA除了可明显降低快的峰电位样反响及慢    反响的幅度，也惹起快反响后低幅度的AHP反响；50 ?滋mol/L GABA + 200 ?滋mol/L BMI 可局部解除GABA对快的峰电位样反响的抑止作用，而AHP幅度稍增高；运用 50 ?滋mol/L GABA + 200 ?滋mol/L BMI + 200 ?滋mol/L saclofen，20 min后，在脑片DCN（n = 4/8 slices），小脑皮层（n = 2/8 slices），去极化电位及AHP进一步加强（图3）。

    　　在50 ?滋mol/L GABA + 200 ?滋mol/L BMI + 200 ?滋mol/L saclofen条件下，我们在耳蜗核丈量了AHP发作的起始时间为6.83 ± 1.92 ms（n = 35 pixels），终止时间为55.08 ± 7.80 ms（n = 30 pixels），持续时间48.02 ± 8.06ms（n = 30 pixels），电位幅度0.043 ± 0.02（△I/I，n = 35 pixels）；在小脑皮层丈量AHP发作的起始时间为6.69 ± 2.52 ms（n = 16 pixels)，终止时间为98.28 ± 28.64 ms(n = 15 pixels），持续时间90.71 ± 29.08 ms（n=15 pixels），电位幅度0.046 ± 0.02(△I/I，n=16 pixels）。

    3　讨　论

    　　本实验在小鼠听觉脑干切片中察看了电刺激位听神经诱发的膜电位变化的光学图谱，GABA及GABAB受体对位听神经传入信号的调理作用。

    　　实验察看到，GABA对电刺激位听神经诱发的去极化电位有明显抑止作用，这一作用与GABA作用于突触前GABAB受体减少兴奋性末梢的递质释放，以及作用于突触后GABAA及GABAB受体惹起抑止性突触后电位有关。

    　　将低浓度（2 ?滋mol/L ）的GABAB受体拮抗剂saclofen单独参加ACSF浸液后，可加强位听神经惹起的去极化电位幅度。这一实验标明位听神经的兴奋性传入通常处于GABA能中间神经元与GABAB受体的张力性抑止之下，saclofen与脑干切片中的GABAB受体分离，可减轻这种抑止状态。这一作用在CN、VNC、小脑均十分显著，提示在这些部位散布着丰厚的GABAB受体。实验结果与以往解剖学和电生理学证据吻合［13-16］。Lujan等运用免疫金标志GABAB1受体亚单位抗体，在电镜程度察看了大鼠CN的GABAB1受体准确的细胞与亚细胞定位，显现在CN的不同部位，GABAB1受体的免疫反响强度不同。GABAB1受体在DCN有较高的分离活性。在DCN表层，相当于梭型细胞与颗粒细胞层，免疫反响最为集中，从表层到深部逐步削弱［13］。Kaltenbach等用电压敏感染料（Di-2-ANEPEQ）给仓鼠在体DCN染色，运用2 kHz ～ 20 kHz频率的声音刺激以诱发仓鼠DCN神经元活动，并记载神经活动的光学反响。他们发现DCN对不同频率刺激的反响中心不同，对低频刺激的反响中心在DCN最表层，对高频刺激的反响中心在DCN内部，频率梯度是平滑的并与DCN由表至里的长轴平行［18］。DCN内神经元所承受的刺激频率似与GABAB1受体的散布密度呈现相反的关系，提示该受体可能与不同频率声音信息的编码功用有关。以往研讨显现GABA免疫反响的散布与背侧耳蜗核内抑止部位的生理学证据分歧，耳蜗核内抑止性神经元可能限制兴奋向外周扩散, 使兴奋集中在较小区域,使频率选择性进步等，由此以为 GABA能神经元及其受体在听神经环路的整合活动中也担负重要功用［19］。

    　　本实验发现，saclofen在较高浓度时可惹起明显的去极化电位加强及后超极化电位（AHP），因而首先需求剖析AHP与抑止性突触后电位的关系。50 ?滋mol/L GABA减低了快的峰电位样反响并惹起一个低幅度的后超极化电位；在50 ?滋mol/L GABA/ 200 ?滋mol/L BMI作用下，后超极化电位幅度稍　　有增高；在50 ?滋mol/L GABA/ 200 ?滋mol/L  BMI/　　　200 ?滋mol/L saclofen共同存在的状况下，后超极化电位幅度进一步增高。以上实验提示 AHP与GABAA或GABAB受体介导的抑止性突触后电位无关。依据实验结果，我们揣测AHP可能与突触前GABAB受体的作用有关：较低浓度（2 ?滋mol/L）saclofen生理性地抑止突触前及突触后GABAB受体，而高浓度的saclofen可能完整阻断突触前GABAB受体的作用，招致谷氨酸从突触前末梢过量释放，受体-门控钙通道开放，钙进入细胞，细胞内对钙敏感的钾外向电流产生，从而显现了去极化加强与AHP。AHP现象主要见于DCN表层及小脑皮层，并与DCN及小脑皮层内突触前GABAB受体的散布吻合，似乎也印证了我们以上的揣测。但是尚需求更多的研讨以证明AHP的发作机制。

    　　听觉脑干的初级与二级神经元普遍散布着GABAB受体，与GABAA受体共同参与中枢听觉信息的处置；前庭复核与小脑在构造功用上互相关联，经过递质受体调理脊椎动物的肌张力及姿位反射等。目前各种递质受体亚型与生理功用的关系是神经生物学研讨的热点，因而进一步展开神经递质受体亚型的研讨是非常必要的。

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