HPLC法测定新生化颗粒中阿魏酸含量及有关物质TLC方法的研究

【摘要】  目的 研讨了重生化颗粒中当归、川芎、炙甘草、益母草的薄层色谱鉴别。办法 采用高效液相色谱法测定了当归、川芎中阿魏酸的含量，调查了办法的精确度和反复性。以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-0.1%磷酸(89：11)为活动项;检测波长为316nm。结果 阿魏酸浓度在Y=3853638.636X-3047.485961 范围具有良好的线性关系(r=0.9999);加样均匀回收率99.19%;RSD为1.12%。结论 经过13批不同厂家消费的样品测定结果标明，实验结果稳定、反复性好、精细度高，为有效地控制该产品的内在质量发明了条件。

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【关键词】  重生化颗粒;TLC;HPLC;阿魏酸

　　Determination on ferulic acid of Xin sheng hua granules by HPLC and to study of related substances by TLC

　　WANG Ke-ying，GUO Jin-Duan,XIAO Zheng-fang，et al.Guizhou Institute for Drug Control,Guizhou 550004,China

　　【Abstract】 Objective To observe biochemical studies of new particles in the Chinese angelica, Chuanxiong, licorice root(broil), motherwort by TLC.Methods Determination on the content of ferulic acid of the Chinese angelica,Chuanxiong by HPLC and to study the method accuracy and repeatability.Using 18 alkyl bonded silica gel as stationary phase and acetonitrile - 0.1% phosphoric acid (98:11) as the mobile phase ,the detective wavelength was 316nm. Results The linear range of ferulic acid was Y=3853638.636 X- 3047.485961ug (r=0.9999),the average recovery rate was 99.19% with RSD= 1.12%. Conclusion Sample determination results show by 13 different manufacturers,the experimental was stable, good repeatability,high precision.The condition was created to effectively control the product’s inherent quality.

　　【Key words】 Xin sheng hua granules;thin-layer chromatography; high performance liquid chromatography; ferulic acid

　　重生化颗粒是由当归、川芎、桃仁、甘草(炙)、干姜(炭)、益母草、红花。七味中药加工精制而成的颗粒剂。具有活血、祛瘀、止痛成效。临床用于产后恶露不行，少腹疼痛，上环节育后惹起的阴道流血，月经过多等症。由于重生化颗粒临床为妇科运用的良药，而在全国消费厂家也较多。现为2010版《药典》一部新增收载的种类，而原规范在质量控制办法上较简单，只要阿魏酸的定性鉴别，为进一步进步完善质量规范，本文采用薄层层析办法对该制剂中当归、川芎、甘草(炙)、益母草, 停止了薄层鉴别，制定了处方中有效成分控制该制剂的含量指标，用高效液相色谱法测定了当归、川芎中阿魏酸的总含量。并对拟定进步的质量规范停止有关办法学的调查，其实验结果稳定，重现性良好，精细度高，为有效地控制该产品的内在质量提供了科学的根据。

　　1 资料与仪器

　　1.1 资料 重生化颗粒来自贵州省汉方制药有限公司、山西仟源药业有限公司、西安兆兴制药有限公司、长沙太宝制药有限公司、安徽天康制药有限公司;对照药材及对照品由中国药品生物制品检定所提供。当归(批号：120927-300613)、川芎(批号：120918-200507)、甘草(批号121303-200502：)、益母草(批号：121114-200502);对照品：甘草苷(批号：110731-200513)、甘草酸(批号：0781-9909)、甘草酸单胺盐(批号：120904-200309)、盐酸水苏碱(批号110712-200407)、阿魏酸(批号：110773-2006611)。

　　1.2 仪器 高效液相色谱仪：岛津SPD-10AVP，SH-IMADZU;CBM-20A(Z中央控制器);SIL-20A;Lc solution色谱数据工作站;KQ-500 DA型;数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱：C18：5μm 250×4.6mm迪玛科学仪器有限公司。实验所用试剂均为剖析纯，水为重蒸馏水。

　　2 实验办法与结果

　　2.1 供试品溶液的制备

　　2.1.1 供试品溶液Ⅰ 取重生化颗粒20g，加水100ml使溶解，于分液漏斗中，用50ml乙醚振摇提取，放置过夜，分取乙醚层(必要时离心消弭乳化层)，水层再加20ml乙醚提取，待分层，兼并乙醚液，自然挥干，残渣加无水乙醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1g,加乙醚40ml，超声处置10min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

　　2.1.2 供试品溶液Ⅱ 取本品30g，研细，加乙醇100ml，超声处置30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30ml，兼并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗濯2次，每次30ml，正丁醇液置水浴挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

　　2.1.3 供试品溶液Ⅲ 取本品10g，研细，加水20ml超声处置30min，放冷，用盐酸调pH值至1～2，装于已处置好的(732型)阳离子交流树脂(取新732型阳离子交流树脂，清水浸泡，洗去破碎的树脂，用10%氯化钠水溶液浸泡24h，装柱，依次用5%盐酸溶液、纯化水、5%的氢氧化钠溶液洗濯，再依次用5%盐酸溶液、纯化水洗至中性，备用)柱上(柱15×1.5cm ,装树脂10cm)，用水洗至近无色，用甲醇-氨水(85:15)150ml洗脱，搜集洗脱液，水浴蒸干，残渣加1%盐酸甲醇1ml溶解，作供试品溶液。

　　2.2 对照品及对照药材溶液的制备 另取当归、川芎对照药材各1g,各加乙醚40ml，超声处置10min，滤过，滤液蒸干，残渣各加无水乙醇1ml使溶解，作为当归、川芎对照药材溶液;再取甘草对照药材1g，加乙醚40ml，加热回流1h，滤过，药渣加甲醇30ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，兼并正丁醇液，用水洗濯3次，每次20ml，分取正丁醇液置水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为甘草对照药材溶液。取益母草对照药材按供试品溶液Ⅲ制备法制备，即得益母草对照药材溶液。取甘草苷、盐酸水苏碱对照品各加甲醇制成1ml含1mg的溶液即得。

　　2.3 空白对照溶液的制备 模仿重生化颗粒处方工艺分别制成不含当归、川芎、甘草、益母草的空白颗粒剂，各自按供试品溶液制备项下的办法制成空白(阴性)对照溶液。

　　2.4 当归、川芎TLC 取供试品溶液Ⅰ，当归、川芎对照药材，空白对照品溶液，各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，正己烷-醋酸乙酯(9：1)为展开剂，展开，置紫外光灯(365nm)下监视，结果标明供试品与对照药材在相同的位置上显相同的颜色莹光斑点，而阴性对照无干扰，无特征斑点。

　　2.5 甘草、甘草苷TLC 取供试品溶液Ⅱ，甘草苷及甘草对照药材溶液，不含甘草的空白对照溶液，各5 ，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(40：10：1)为展开剂，预饱和20min，展开、取出、晾干、喷以10%硫酸乙醇溶液。105℃加热至斑点明晰，结果标明供试品色谱中，在与甘草苷对照品、甘草对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照无干扰，无特征斑点。

　　2.6 益母草及盐酸水苏碱TLC 取供试品溶液Ⅲ,盐酸水苏碱及益母草空白对照品溶液，不含益母草的空白对照溶液，各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸(5:3:0.5)为展开剂，展开、取出、晾干，于105℃烘10min，喷以改进碘化铋钾，结果标明供试品色谱中，在与盐酸水苏碱对照品、益母草对照药材在相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照无干扰，无特征斑点。

　　2.7 当归、川芎中阿魏酸总含量的测定。

　　2.7.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsi/C18：5μm 150×4.6mm, 活动相，乙腈-0.41%磷酸(11：89);流速为1.0ml/min; 检测波长316nm。

　　2.7.2 样品溶液的制备 精细称装量项下的本品3g，置具塞锥形瓶中精细加甲醇20ml，称定重量后，超声1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，用0.45微孔滤膜过滤即得。

　　2.7.3 对照品溶液的制备 精细称取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含10g的溶液即得。

　　2.7.4 规范曲线制备 精细称取对照品适量，加甲醇制成0.009176mg/ml的溶液，精细汲取上述溶液1μl、5μl、10μl、14μl、18μl按次第进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，阿魏酸为横坐标绘制规范曲线，得回归方程 Y=3853638.636 X-3047.485961 (r=0.9999)阿魏酸线性范围为0.009176～0.165168μg。

　　2.7.5 精细度实验 精细汲取上述对照品溶液(0.009176mg/ml)10μl，反复进样6次，得峰面积RSD为0.63%。

　　2.7.6 稳定性实验 精细汲取样品溶液10μl，每隔0、1、2、4、8、12、24h进样1次，RSD1.58%，在24h内稳定性良好。

　　2.7.7 反复性实验 按供试品制备办法分别制备6份样品溶液，按上述色谱条件测定，大黄素含量RSD为0.97%，反复性良好。

　　2.7.8 加样回收率实验 精细汲取已知含量(0.0486ml/g)的重生化颗粒样品，参加一定量的对照品溶液，按上述同等色谱条件测定阿魏酸的回收率，结果见表1。表1 重生化颗粒阿魏酸回收率

　　2.7.9 样品测定 精细汲取样品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件，各测定3次，计算样品溶液中阿魏酸的含量，结果见表2。表2 样品测定结果 (n=3)

　　3 讨论

　　重生化颗粒全国有31个消费批文，多个消费厂家消费有不同规格的产品，本实验搜集了5个消费厂家，2种规格的样品共13批，该种类为2010版《药典》新增收载的种类，原规范只要当归TLC的鉴别，为进步质量规范，依据请求我们增加了该种类应该控制的办法。原规范当归的鉴别提取办法用乙醚、苯等溶剂提取屡次很烦琐，用甲苯作为展开剂，思索到提取溶液剂及展开剂毒性较大，经过实验探索，办法改为同时鉴别当归和川芎，取样品加50ml乙醚振摇提取，分取乙醚层自然挥干即得，展开剂改为正己烷-乙酸乙酯，该法烦琐，展开剂合理。炙甘草的TLC鉴别为新增加项，同时探索了甘草对照药材、甘草苷、甘草酸及甘草酸单胺盐成分的鉴别办法，但由于受糖的干扰，前处置很艰难，而甘草酸及甘草酸单胺盐成分的鉴别不理想，故未列入正文。我们用HPLC测定法探索了盐酸水苏碱含量，经过不同型号的高校液相色谱仪和色谱柱及多种办法的提取和活动相的探索，均未得到理想的结果，同时我们也参照《中国药典》2005年版一部益母草办法，用薄层扫描法测定益母草中盐酸水苏碱含量，经过实验调查证明，薄层扫描法精细度及反复性较差，受温度的影响也大，故未列入正文。用TLC法鉴别样品中的益母草及益母草中的盐酸水苏碱，样品提取较艰难，经过用途理好的(732型)阳离子交流树脂处置，除去糖的干扰，得到称心的结果。思索到当归、川芎为本处方中的君臣药，故我们采用高效液相色谱法测定重生化颗粒中当归、川芎的阿魏酸含量之和，经过不同消费厂家13批样品测定及办法学调查，得到称心的结果，到达本质量量控制的目的。

　　经过实验结果标明，该质量规范薄层鉴别项能鉴别的对照药材及对照品专属性强，被检各药空白溶液均无干扰。均到达别离效果。结果容易判别。各项鉴别经预制板和手铺板调查，反复性好，精细度高，到达在消费工艺中药材投料质量的控制。树立了高效液相色谱法测定重生化颗粒中阿魏酸的含量测定办法，经办法学调查标明，该法精确、灵活、简单、快速，为新版药典重生化颗粒种类提供了质量规范控制的科学根据。

【参考文献】
  　1 国度药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社，2005,28;59;89.

　　2 程立方,崔秀君.产舒康颗粒中盐酸水苏碱的高效液相法测定.中国现代应用药学杂志,2007,12(24):653-654.

　　3 祝业光,杨照彦,王素芹,等.HPLC法测定清宫止崩颗粒中盐酸水苏碱含量. 中国药事,2006,20(6):357-358.

　　4 童红,何斌.高效液相法测定抗宫炎软胶囊中盐酸水苏碱含量.中国药业,2007,16:14.

　　5 李文仕.益母草颗粒的质量控制.中国药师，2008,11:4.

　　6 冯旭,杜成智,梁臣颜,等.HPLC-ELSD测定益母草中盐酸水苏碱的含量.广西中医药,2007,30(6):53.