HPV16 E6与p53 Arg72Pro基因的多态性

【摘要】  目的 讨论HPV16 E6对p53 Arg72Pro不同基因型的p53蛋白及其功用相关蛋白表达的影响，为研讨宫颈癌的致癌机制提供理论根据。办法 用脂质体法将真核表达载体pcDNA3.1/mycHis() AHPV16 E6转染p53Arg和p53Pro细胞，经过免疫细胞化学办法对转染前后两种细胞内p53、p21、Bax、Ki67蛋白停止检测。结果 转染后两种细胞内p53、Bax、Ki67蛋白的表达均遭到影响，但p21蛋白变化不大。结论 两种细胞内p53蛋白均可被降解，被降解后两者抑止细胞增殖才能和诱导细胞凋亡才能降低的水平不同，经过不同机制招致宫颈癌的发作。

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【关键词】  p53基因；多态性；HPV；细胞周期；凋亡

  Correlation between HPV16 E6 and p53Arg72Pro Polymorphisms

    LI Xinmin*，PAN Xiaolin，YANG Anqiang，ZHENG Xingzheng，ZHOU Qiuyuan

    Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease / Department of Pathology，Shihezi University，Shihezi 832002，China（*Present:The Maternal and Child Health Care Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450053）

    Corresponding  Author: PAN Xiaolin,Email:pxl1025@Yahoo.com.cnAbstract：Objective   To discuss correlation between HPV16 E6 and p53Arg72Pro polymorphisms, it provided academic evidence for the mechanism of cervical cancer.Methods  pcDNA 3.1/mycHis () AHPV16 E6 was transfected into p53 codon 72 genotype cell lines, Arg homozygous (SKBR3) and Pro homozygous (MIA PaCa2). Immunocytochemistry was used to detected the expression of protein of p53、p21、Bax、Ki67 proteins in these cells which were transfected by HPV16 E6.Results  After being transfected, the expression of p53、Bax、Ki67 were effected in those cells, expect for p21 protein.Conclusion  After the eukaryotic expression vector pcDNA3.1/mycHis () AHPV16 E6 was transfected into the Arg homozygous and Pro homozygous cells, the p53Arg and p53Pro proteins were all degraded by HPV16 E6. And the ability of proliferation and apoptosis of the cells were depressed to a different degree.

    Key words：p53 gene； Polymorphism； HPV； Cell cycle； Apoptosis

 p53基因是机体内最重要的抑癌基因，它经过转录激活下游基因p21、p16、Gadd45、bax在细胞周期的调控、DNA修复、细胞凋亡等方面来发挥其抑癌效应。目前研讨显现p53功用丧失与大约70%人类肿瘤的发作有关，人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染招致p53蛋白功用失活就是宫颈癌的主要致病要素。国内外研讨显现大约99.7％的宫颈鳞癌和70％的宫颈腺癌中能够检测到高危型HPV[1]。其中HPV16和18与宫颈癌的发作最相关，其编码的E6蛋白失活机体p53蛋白是以宫颈癌为主的HPV相关肿瘤的主要致癌机制。

    近年来的研讨显现p53基因第4外显子第72位密码子(p53 Arg72Pro)编码的两种蛋白p53Arg和p53Pro功用失活与宫颈癌的发作开展关系亲密，但是在宫颈癌发作机制中的作用尚不分明，故本文提出假说：p53Arg和p53Pro蛋白被HPV16 E6蛋白降解失活后，两者可能经过以细胞增殖活性增高为主的机制或以诱导细胞凋亡才能降低为主的机制招致宫颈癌的发作。

    1  资料和办法

    1.1  资料  细胞株、载体 p53Arg纯合型(SKBR3)细胞购于中国协和医科大学根底医学院细胞中心；p53Pro纯合型(MIA Paca2)细胞购于ATCC。质粒pSP64HPV16 E6由意大利国际遗传和生物工程中心Lawrence Banks教授惠赠。

    1.2  细胞培育  p53Arg和p53Pro细胞分别在含10%小牛血清的McCoys 5A培育液和DMEM培育液中，37℃、5%CO2 、恒定湿度培育。

    1.3  HPV16 E6基因真核重组质粒的构建及细胞转染  将HPV16 E6基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/mycHis () A (美国Invitrogen 公司)中，得到重组质粒pcDNA3.1/mycHis () A HPV16 E6。用Lipofectamine 2000 (invitrogen公司)转染，48～72h后用于实验剖析。

    1.4  细胞总RNA提取  将转染后培育的p53Arg和p53Pro细胞用Trizol试剂盒(BBI公司)分别提取总RNA(按阐明书停止)。测定RNA浓度，1% Agarose审定纯度。

    1.5  逆转录聚合酶链反响(RTPCR)  依据HPV16 E6 mRNA序列(GenBank Accession  AF486313)设计逆转录PCR引物, 上游引物：5′CGCGGATCCATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTT3′，下游引物：5′CATGCAAGCTTCAGCTGGGTTTCT3′；内参照βactin上游引物： 5′CATGTTTGAGACCTTCAACACC3′, 下游引物：5′TTGCCAATGGTGATGACCTG3′。于55℃30min逆转录，94℃ RTase失活2min后，在92℃30s、54℃30s、72℃1.5min条件下30个循环，72℃6min延伸。取5μl扩增产物于2%Agarose电泳检测，DH2000剖析软件计算HPV16 E6与βactin电泳条带吸光度积分的比值作为HPV16 E6mRNA程度的相对值。

    1.6  实验分组  p53Arg和p53Pro细胞各分3组：①未转染组(未染任何载体)；②转染E6组(转染pcDNA3.1/mycHis() AHPV16 E6)；③转染空载体组(转染pcDNA3.1/mycHis() A)。

    1.7  免疫细胞化学办法  采用Envision法，p53抗体(1∶150)，p21抗体(1∶100)，Ki67抗体(1∶75)，Bax抗体(1∶200)，均为福州迈重生物技术开发有限公司的单克隆抗体。用试剂盒内乳腺癌阳性标本作阳性对照，用PBS替代一抗作空白对照。

    1.8  结果剖析  未转染组和转染E6组两种细胞分别选取5张片子，转染空载体组分别选取4张片子，每张片子随机选取5个视野，p53、p21、Bax指标用Imagepro 5.1 Chinese软件测阳性产物的均匀灰度值，以OD值表示；Ki67以阳性细胞百分比(%)表示。

    1.9  统计学办法  采用SPSS13.0统计软件，Ki67比拟用H检验；p53、p21和Bax比拟用单要素方差剖析。

    2  结果

    2.1  转染后细胞内mRNA的审定  2%Agarose电泳审定显现，在680bp处有内参照βactin的条带，两泳道在497bp处均扩增出特异性条带，标明两种细胞内含有HPV16 E6基因，转染胜利，见图1、2。

    2.2  转染细胞中免疫细胞化学检测结果

    2.2.1  p53蛋白的表达  两种细胞中p53蛋白定位于细胞核内，呈棕褐色/棕黄色颗粒状为阳性。在两种细胞内，转染空载体组与未转染组相比，p53蛋白表达差别均无统计学意义；转染E6组与未转染组相比，p53蛋白表达强度均降低，见表1。比拟降低趋向发现：p53Arg蛋白降低较明显，见图3。

    2.2.2  p21蛋白的表达  两种细胞中p21蛋白定位于细胞核内，呈浅黄色颗粒状为阳性。结果显现转染前后，这两种细胞内根本无阳性细胞。

    2.2.3  Ki67蛋白的表达  两种细胞中Ki67蛋白定位于细胞核内，呈棕褐色/棕黄色颗粒状为阳性。在两种细胞内，转染空载体组与未转染组相比，Ki67蛋白表达差别均无统计学意义；转染E6组与未表1  两种细胞中转染HPV16 E6前后p53蛋白的表达( *：P=0.000(P<0.05)；﹟：P=0.001(P<0.05)  compared with no transfection转染组相比，Ki67蛋白表达强度均增高，见表2。比拟转染后增高趋向发现，p53Pro细胞内Ki67蛋白增高较明显，见图4。表2  两种细胞转染HPV16 E6前后Ki67蛋白表达的阳性率 *：χ2=3.938，P=0.047(P<0.05)；﹟：χ2=5.771，P=0.016(P<0.05) compared with no transfection2.2.4  Bax蛋白的表达  两种细胞中Bax蛋白定位于细胞浆内，呈浅黄色颗粒状为阳性。在p53Arg细胞中，Bax蛋白表达三组相比差别均无统计学意义。在p53Pro细胞中，转染空载体组与未转染组相比，Bax蛋白表达差别无统计学意义；转染E6组与未转染组相比，Bax蛋白表达强度降低，见表3。比拟转染后降低趋向发现，p53Pro细胞内Bax蛋白降低稍明显，见图5。表3  两种细胞转染HPV16 E6前后Bax蛋白的表达

    3  讨论

    高危型HPV16与宫颈癌的发作亲密相关，其编码的E6蛋白降解p53蛋白，使p53丧失细胞周期调控、诱导凋亡和DNA修复功用是宫颈癌发作的主要机制。近年来研讨显现p53 Arg72Pro基因多态性编码的p53Arg和p53Pro蛋白的功用失活可能经过不同的机制惹起肿瘤的发作：p53Arg具有较强的与高危型HPV E6蛋白分离、诱导凋亡和抑止细胞转化的才能[23]；p53Pro具有较强的转录激活下游基因p21、Gadd45的才能，因而具有较强的细胞周期阻滞和DNA修复功用[4]。

    本研讨显现： p53Arg和p53Pro蛋白均能够被HPV16 E6局部降解，但p53Arg降低的水平比p53Pro蛋白明显，这与1998年Storey等[5]和1999年Thomas等[2]研讨结果分歧，均提示p53Arg可能更易与HPV16 E6蛋白分离构成p53/E6/E6AP蛋白复合体或者p53/E6/p300蛋白复合体而被降解[57]，因而，p53Arg功用失活能加强HPV相关宫颈癌的易理性[5,8]。

    p53表达降低，可下调p21的转录激活才能。但是本研讨中HPV16 E6作用前后p21蛋白在两种细胞中根本不表达，提示两种细胞内p21蛋白的表达不受p53Pro和p53Arg转录激活影响，与局部文献报道[910]两种细胞内根本无p21蛋白的表达结果分歧；但与Su等[11]的结果不分歧，他们发现p53 Pro比p53Arg更能显著激活p21 mRNA表达。

    转染后，两种细胞内Ki67增殖指数均增高，这与Thomas等[2]的研讨结果分歧。正常状况下，p53蛋白对细胞周期的阻滞作用主要是经过G1/S期监测点调理，p53启动p21/ p16转录，p21/p16与cyclinECDK2/cyclinDCDK4/6复合物分离，两个复合物均可抑止CDK激活，使Rb去磷酸化，阻止E2F释放使细胞周期停滞在G1/S，为DNA修复提供足够的时间[12]。本研讨中发现两种细胞内p21蛋白根本不表达，但Ki67增殖指数均增高提示p53Arg和p53Pro蛋白被降解后对细胞周期的阻滞作用均削弱，且p53Pro蛋白被降解后对细胞周期阻滞作用削弱更明显。揣测这两种多态蛋白对细胞增殖的负调理可能是经过转录激活p16途径。p53Arg和p53Pro蛋白被HPV16 E6降解后，转录激活p16才能削弱，细胞周期阻滞作用降低，且p53Pro蛋白被降解后对细胞周期的阻滞作用降低较明显。

    p53Arg和p53Pro蛋白被HPV16 E6作用后，转录激活促凋亡基因bax的研讨结果显现，p53Pro转录激活bax的才能明显降低，提示p53Pro诱导细胞凋亡才能较强。这与局部学者的研讨结果分歧，他们以为p53Pro作为SH3分离区域内5个PXXP分离基序之一，参与调控细胞凋亡功用[13]，其诱导细胞凋亡才能应比p53Arg强。2006年Bergamaschi等[14]研讨也发现p53Pro的转录活性和诱导细胞凋亡的才能可被ASPP蛋白加强。但与Dumont、Sullivan等[3,15]的研讨结果不分歧，他们以为p53Arg比p53Pro更有效地诱导细胞凋亡，可能是由于：p53Arg有效转录激活AIP1和PIGPC1基因，更有效地诱导细胞凋亡；且p53Arg与核输出蛋白CRMⅠ分离有效地定位线粒体，再与线粒体GRP75蛋白互相作用促进细胞凋亡。可见，p53 Arg72Pro基因多态性编码的两种蛋白被降解后，两者抑止细胞增殖才能和诱导细胞凋亡才能降低的水平不同，经过不同机制招致宫颈癌的发作：p53Pro细胞增殖活性增高较明显；p53Pro细胞诱导凋亡才能降低较明显；两种蛋白对p21基因转录激活均没有明显的影响。

    综上所述，本文经过将真核表达载体pcDNA3.1/mycHis() AHPV16 E6转染p53Arg和p53Pro细胞，讨论HPV16 E6对p53 Arg72Pro不同基因型的p53蛋白及其功用相关蛋白表达的影响，对宫颈癌发作机制的研讨有重要意义。

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