HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达

【摘要】  目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体，并察看其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响，探究反义技术用于治疗临床HPV感染及宫颈癌的可能性。办法 以HPV18型全基因质粒为模板，PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段，应用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFPC1，EcoR I酶切并测序审定；采用脂转法将重组质粒pEGFPHPV18E6E7as（EGFP18AS）转染宫颈癌HeLa细胞株，经过RTPCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达。结果 胜利构建HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体EGFP18AS，经脂质体转染HeLa细胞，48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光，且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达程度均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体能够有效的抑止HPV18 E6、E7癌基因的表达，为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的办法。

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【关键词】  人乳头瘤病毒18型；E6/E7；反义；EGFP；宫颈癌

    宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，其发病率仅次于乳腺癌，但在广阔开展中国度其发病率居首位，约占女性恶性肿瘤总数的25%[1]。研讨标明，99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，特别是16、18型等高危型HPV与宫颈癌发作关系亲密。现已证明高危型HPV早期蛋白中的E6和E7为宫颈上皮恶性转化中的关键蛋白，因而针对E6、E7基由于靶点的治疗手腕成为我们研讨的重点。反义技术是近年来兴起的一种基因治疗技术，该技术能够高效、特异的阻断目的基因的表达。因而应用反义技术从基因程度封锁病毒癌基因E6、E7，有望成为宫颈癌基因治疗的有效途径[2]。本研讨胜利构建了可表达HPV18的E6、E7反义RAN的荧光真核表达载体，经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞株，观测其关于HPV18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响，为临床HPV感染及宫颈癌治疗探究新的办法。

    1  资料与办法

    1.1  载体、菌株和细胞株  含有HPV18规范全长基因的质粒由德国海德堡大学EthelMichele de Villiers教授惠赠。真核表达载体pEGFPC1购自Clontech公司。HeLa细胞购自美国典型培育物保藏中心（ATCC），大肠杆菌株DH5α由本室保管。

    1.2  引物和测序  扩增HPV18E6E7基因片段的引物：P1 5\' TAA TCG ATA TAA TCC AAC ACG GCG ACC C 3\'，P2 5\' GGG ATC GAT GGC TTT CTA CTA CTA GCT CAA T 3\'。检测HPV18的E6基因的引物：P1 5\' GGC GAC CCT ACA AGC TAC CTG A 3\'，P2 5\' TTC TCT GCG TCG TTG GAG TCG TTC 3\'。检测HPV18的E7基因的引物：P1 5\' AAG CGA CTC AGA GGA AGA 3\'，P2 5\' CAC AAA GGA CAG GGT GTT 3\'。内参照βactin的引物：P1 5\'AGC CAT GTA CGT TGC TAT CC3\'，P2 5\'TTG GCG TAC AGG TCT TTG C3\'。内参照GAPDH的引物：P1 5\'GGA GCC AAA AGG GTC ATC A3\'，P2 5\'GCC ATC ACG CCA CAG TTT C3\'。5个PCR扩增产物长度分别为716、440、199、498、255bp。上述一切引物的合成和测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。

    1.3  主要试剂  RNA提取试剂TRIzol和细胞培育基DMEM购自Gibco公司，Taq DNA聚合酶和T4衔接酶为MBI公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，逆转录酶MMLV购自Promega公司，限制性内切酶EcoR I为TaKaRa公司产品。HPV16/18 E6抗体（sc460）、HPV18 E7抗体（SC1590）和βactin抗体（sc1616R）购自Santa Cruz公司。ECL试剂盒购自Pierce公司。

    1.4  载体构建和审定  以含有HPV18全长基因组的质粒为模板，行PCR扩增HPV18E6E7基因片段，条件如下：95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。PCR产物衔接T载体，蓝白斑筛后EcoR I酶切取得目的片段，然后将其与经EcoR I酶切线性化的pEGFPC1 16℃衔接。衔接产物转化DH5α菌株，挑取单克隆，酶切和测序审定。将测序为反向构建胜利的质粒命名为pEGFPHPV18E6E7as（EGFP18AS）。

    1.5  细胞培育和转染  用EGFP18AS和pEGFP（对照质粒）分别经Lipofectamine 2000转染HeLa细胞后继续培育，6～8h后开端在荧光倒置显微镜下察看绿色荧光并评价其转染效率。

    1.6  RTPCR检测  转染后48h分别用TRIzol试剂提取转染EGFP18AS、pEGFP的SiHa细胞及未处置的SiHa细胞的总RNA，各取2μg mRNA，依照逆转录酶MMLV阐明书停止逆转录，再取等体积cDNA模板，用检测HPV18的E6、E7基因的引物停止RCR扩增，条件如下：95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，30个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。同时PCR扩增βactin或GAPDH作为内参照。

    1.7  Western blot检测  在转染后48h分别用三去污法提取上述三组细胞总蛋白，测定浓度后取50μg蛋白上样，用Western blot检测细胞中E6、E7蛋白的表达。详细办法如下：蛋白经SDSPAGE 60V电泳1.5h后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，后5%脱脂奶37℃封锁1h，一抗（1∶100）4℃过夜，相应二抗（1∶3000）37℃孵育1h，ECL试剂盒化学发光后曝光成像，同时检测βactin（1∶500）的表达作为内参照。

    2  结果

    2.1  HPV18 E6E7基因片段的扩增和EGFP18AS重组载体的审定  从含有HPV18规范全长基因的质粒中扩增目的片段，大小为0.7kb。将重组质粒用EcoR I酶切，取得两条大小为4.7kb和0.7kb的片段，与载体和目的片段吻合。测序证明重组载体中的插入序列与目的基因序列反向匹配。

    2.2  HeLa细胞的转染  EGFP18AS和pEGFP两种质粒转染HeLa细胞后6h在荧光显微镜下可察看到少量绿色荧光，24h表达量明显增加，48h到达顶峰。

    2.3  转染后48h E6、E7表达的变化   用RTPCR检测转染前后E6、E7基因的mRNA的变化，见图1。结果显现，EGFP18AS转染后48h，HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA较转染空质粒与未处置细胞显著减少，转染空质粒和未处置细胞间无明显差别。用Western blot检测转染前后E6、E7基因的蛋白的变化，见图2。结果显现，EGFP18AS转染后48h，HeLa细胞中E6、E7蛋白较转染空质粒和未处置细胞显著减少，转染空质粒细胞与未处置细胞间也无明显差别。

    3  讨论

    人乳头瘤病毒是一种在人群中普遍盛行的双链DNA病毒，具有嗜上皮性，易侵袭皮肤和黏膜。依据其基因组DNA的同源性，HPV可分为110多个型别。在宫颈癌患者的宫颈组织中常可检出HPV，特别是所谓高危型HPV。现有的盛行病学和分子生物学材料证明，高危型HPV的持续感染是招致宫颈癌的主要病因。HPV的致癌机理主要是病毒DNA整合于宿主基因组，异常表达病毒癌基因E6、E7。E6和E7基因分别编码含约180个氨基酸和100个氨基酸的癌蛋白。E6蛋白能够特异地与抑癌基因产物p53分离，经过泛素途径快速诱导抑癌基因p53降解，招致G1期停止DNA损伤修复的生理性停滞被解除；E7蛋白可与抑止基因pRb分离，使pRb高磷酸化失活，释放出原分离于pRb的核转录因子E2F。有研讨[3]标明，E6、E7蛋白不只在上皮细胞的恶性转化中起着重要的作用，对肿瘤的恶性表型的维持也起着最重要的作用。Yoshinouchi等[4]以为E6和E7不只能够转化人上皮细胞，且表达高危型HPV的宫颈癌细胞株在在阻断E6、E7的状况下能够发作恶性表型的逆转。这些研讨结果标明，阻断HPV的E6、E7基因，有可能成为宫颈癌基因治疗的有效途径[5]。

    HPV18型是一种高危型HPV，与宫颈腺癌关系亲密。Steele[6]的研讨标明，封锁HPV18的E6和E7基因将明显减缓HeLa等含HPV18的肿瘤细胞的生长，惹起细胞周期阻滞。用HPV18 E6基因的反义RNA[6]和siRNA[7]作用于宫颈癌细胞，HPV18 E6蛋白的表达明显降低，细胞凋亡显著增加。我们在以前的研讨中构建了表达HPV16 E7基因反义RNA的腺相关病毒载体[8]，结果标明能够阻断E7pRb通路，惹起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。思索到HPV18型的E6和E7由同一条mRNA表达，是一对双顺反子基因[7]，两个基因严密相邻。本次研讨中，我们设计了针对HPV18型的E6、E7基因的反义片段。结果显现，我们构建的真核表达载体能够显著减少HPV18型E6、E7基因的mRNA和蛋白的表达。这些结果标明，HPV18型E6、E7基因的反义RNA能够从mRNA程度上封锁E6、E7基因，减少E6、E7癌蛋白的表达，从而有可能从E6p53、E7pRb两条通路上阻断肿瘤细胞的恶性增殖，诱导细胞凋亡。这就为我们应用HPV18型E6、E7基因的反义RNA来治疗HPV感染和预防宫颈癌发作提供了理论根据。

【参考文献】
  ［1］ Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer\\[J\\]. Clin Microbiol Rev, 2003,16(1):117.

\\[2\\] Rorke EA. Antisense human papillomavirus (HPV) E6/E7 expression, reduced stability of epidermal growth factor, and diminished growth of HPVpositive tumor cells\\[J\\]. J Natl Cancer Inst, 1997,89(17):12431246.

\\[3\\] Nomine Y, Masson M, Charbonnier S, et al. Structural and functional analysis of E6 oncoprotein: insights in the molecular pathways of human papillomavirusmediated pathogenesis\\[J\\]. Mol Cell, 2006,21(5):665678.

\\[4\\] Yoshinouchi M, Yamada T, Kizaki M, et al. In vitro and in vivo growth suppression of human papillomavirus 16positive cervical cancer cells by E6 siRNA\\[J\\]. Mol Ther, 2003,8(5):762768.

\\[5\\] Shillitoe EJ. Papillomaviruses as targets for cancer gene therapy\\[J\\]. Cancer Gene Ther, 2006,13(5):445450.

\\[6\\] Steele C, Sacks PG, AdlerStorthz K, et al. Effect on cancer cells of plasmids that express antisense RNA of human papillomavirus type 18\\[J\\]. Cancer Res, 1992,52(17):47064711.

\\[7\\] Yamato K, Fen J, Kobuchi H, et al. Induction of cell death in human papillomavirus 18positive cervical cancer cells by E6 siRNA\\[J\\]. Cancer Gene Ther, 2006,13(3):234241.

\\[8\\] Wu S, Meng L, Wang S, et al. Reversal of the malignant phenotype of cervical cancer CaSki cells through adenoassociated virusmediated delivery of HPV16 E7 antisense RNA\\[J\\]. Clin Cancer Res, 2006,12(7 Pt 1):20322037.