Id1在子宫内膜腺癌中的表达及与VEGF、TSP1的关系

　【摘要】目的 探讨DNA结合抑制蛋白(Id1)在子宫内膜腺癌组织中的表达以及与血管内皮生长因子(VEGF)、血小板反应素1(TSP1)的关系。 方法 免疫组织化学法检测56例子宫内膜腺癌、18例子宫内膜不典型增生、20例正常子宫内膜组织中Id1及VEGF、TSP1蛋白的表达;图像分析软件进行量化处理。 结果 子宫内膜癌组织中Id1表达高于正常子宫内膜组织及子宫内膜不典型增生(P<0.05)，且与组织分化程度及浸润肌层深度、手术病理分期有关(P<0.05)。子宫内膜癌组织中Id1与VEGF表达呈正相关性(r=0.318，P=0.017)，与TSP1呈负相关(r=-0.453，P=0.000)。Id1表达与生存时间无关(P>0.05)。 结论 Id1在子宫内膜腺癌中存在着过表达;抑制TSP1和促进VEGF可能是Id1参与子宫内膜腺癌的发生发展的一个机制。

　　【关键词】 抑制蛋白 子宫内膜肿瘤 血管内皮生长因子类 血小板 反应素类

　　DNA结合抑制蛋白1(inhibitors of DNA binding1，Id1)是1990年代发现的一种分化抑制因子，动物实验发现，Id1可促进细胞增殖，参与肿瘤血管的生成，促进肿瘤的生长及转移[1]。本实验检测子宫内膜腺癌、子宫内膜不典型增生和正常子宫内膜组织中Id1、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及血小板反应素1(thrombospondin1，TSP1)蛋白的表达，初步探讨Id1在子宫内膜癌的发生发展中的意义及与血管生成及抑制因子之间的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 1999年1月1日-2006年10月31日，笔者共收集病例94例，分3组：(1)经手术获取子宫内膜腺癌标本56例，中位年龄55岁(20～76岁);(2)手术切除或门诊刮取的子宫内膜不典型增生标本18例，中位年龄52岁(42～68岁);(3)因子宫肌瘤行子宫切除术的正常子宫内膜20例，中位年龄46(38～59)岁。术前均经病理确诊，均未行放疗、化疗及激素治疗。按照FIGO 2000年子宫内膜癌手术病理分期。从手术当日至2006年12月31日，56例子宫内膜腺癌共随访到47例，随访率83.9%，随访时间30.2月(2～90月)，死亡9例，5年生存率80.9%。

　　1.2 主要试剂和方法 Id1兔抗人多克隆抗体(克隆号：C20，美国Santa Cruz公司)，TSP1鼠抗人单克隆抗体(克隆号：301221，美国R&D公司)，即用型鼠抗人VEGF单克隆抗体(克隆号：VG1，美国Neomarker公司)，二抗及DAB显色剂购自福州迈新生物技术有限公司。采用二步法免疫组织化学染色(EnVision System)测定，Id1工作浓度为1∶100，TSP1工作浓度为1∶30。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替第一抗体作为阴性对照。具体步骤按说明书进行。

　　1.3 免疫组织化学结果判断 Id1、TSP1、VEGF阳性染色呈棕黄色颗粒沉着，主要位于子宫内膜腺上皮细胞的细胞质、腺体的分泌物及肿瘤细胞质内，肿瘤内间质中亦有少量阳性颗粒。阳性产物的结果判断采用ImagePro Plus 6.0图像分析软件进行量化处理：以5个视野的最终平均光密度值作为评价标准，数值越大阳性表达越强。

　　1.4 统计学处理 应用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，定量资料多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，指标间相关性分析采用线性相关，生存情况采用KaplanMeier曲线表示，Log rank检验。检验水准α=0.05，以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Id1、TSP1、VEGF蛋白在各组组织表达 Id1、TSP1、VEGF表达主要定位于正常子宫内膜腺上皮细胞质和肿瘤的细胞质(图l)。从正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生到子宫内膜癌组织Id1、VEGF表达逐渐升高，TSP1表达逐渐降低。Id1、VEGF表达在子宫内膜癌中表达均明显高于其他组(Id1：F=60.768 1，VEGF：F=33.774 6，均为P<0.05)，TSP1表达明显低于其他两组(F=9.6388，P<0.05)，具体见表1。表1 Id1、TSP1、VEGF在各类子宫内膜组织中的表达

　　2.2 Id1、TSP1、VEGF表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系 Id1随着组织学分级(F=23.324)、肌层浸润深度(t=2.296)、手术病理分期(t=3.3714)增加阳性表达增强(均为P<0.05)。VEGF蛋白随着肌层浸润深度、组织学分级、淋巴结转移、手术病理分期增加表达增加，而TSP1表达却相反。经统计学分析，两者均与病理特征无关(P>0.05，表2)。

　　2.3 子宫内膜癌组织中Id1、TSP1、VEGF表达的相互关系 子宫内膜癌组织中Id1与VEGF表达呈正相关性(r=0.318，P=0.017)，与 TSP1呈负相关(r=-0.453，P=0.000)，TSP1表达与VEGF无相关性(r=-0.239，P=0.077)。

　　2.4 子宫内膜癌组织中Id1表达与患者生存时间的关系 将子宫内膜癌组织中Id1表达以中位数分高低两组。两组五年生存率分别为83.3%(18/23)、78.3%(20/24)，两者比较差别无统计学意义(P>0.05，图2)。

　　3 讨 论

　　Id1属于螺旋环螺旋(HLH)转录因子，缺乏DNA结合域，可与一些转录因子(主要是bHLH蛋白)形成非活性异二聚体，使其不能与DNA上的E基序结合，从而负向调控细胞分化，阻止细胞正常分表2 Id1表达与子宫内膜癌临床病理学特征的关系化。在哺乳动物细胞中，Id蛋白由Id1～4四个亚型构成，其功能不尽相同。Id基因具有癌基因的特性，Id1在前列腺癌、食管鳞状上皮癌和子宫内膜癌等肿瘤中有过表达[24]。本研究显示，Id1在子宫内图2 子宫内膜癌Id1高表达组和低表达组KaplanMeier生存曲线

　　Fig 2 KaplanMeier survival curve in patients with the Id1 higher and lower expression in endometrial adenocarcinoma

　　膜癌中表达明显高于正常及不典型增生子宫内膜，组织分化越差、肌层浸润加深以及病理分期升高，Id1表达越强，提示Id1与子宫内膜癌的发生发展有联系。有学者发现，Id1的表达水平与肿瘤的侵袭程度和不良的临床预后相关[23]，但也有学者认为，Idl表达与胃癌的预后无明显相关性[5]。另有报道，只有Id2而非Id1～3三个亚型与患者的生存时间有关[6]，本研究也显示，Id1的表达与患者生存时间无关，可能与Id蛋白表达存在组织特异性、其在各种组织的发育过程中发挥不同作用有关，需要扩大样本以及延长随访时间进一步观察。

　　Id1在肿瘤血管生成中也发挥重要的作用。VEGF是Id1的一个下游靶基因，Id1通过诱导VEGF表达促进肿瘤血管生成[7];也有研究报道，肿瘤细胞释放VEGF刺激骨髓来源前体内皮细胞和造血祖细胞，上调Id1基因表达，Id1在VEGF信号传导途径中起关键作用[8]。这两种观点似乎并不矛盾，推测可能是Id1诱导VEGF表达，VEGF又通过正反馈机制促进Id1表达。本研究中，子宫内膜癌组织Id1与VEGF表达呈正相关，说明在子宫内膜癌肿瘤血管的生成过程中，Id1与VEGF可能起到协同促进作用。血管的形成主要取决于血管形成促进因子与抑制因子之间的平衡。Id1与TSP1呈负相关，提示Id1可通过抑制内源性血管生成抑制因子TSP1转录，从而起到诱导血管生成作用[9]。从正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生到子宫内膜癌组织，VEGF表达逐渐升高，TSP1表达逐渐降低，说明一般情况下人体内血管处于静息状态，组织中抑制因子的影响占主导地位，不会有新生血管生成。当组织发生肿瘤时，原有调控血管生成的平衡被打破，即发生血管生成过程。子宫内膜癌组织中Id1表达与VEGF呈正相关，与TSP1呈负相关，说明TSP1的负调节作用由于受到Id1的抑制，其抑制血管的能力下降，仍然不足以克制VEGF的促血管作用，新生血管不能被抑制，病变不断发展。这可能是子宫内膜癌发生发展中血管形成促进因子与抑制因子之间平衡被打破的一个表现，而Id1在这个失衡的过程中起关键性的作用。

　　总之，Id1子宫内膜腺癌中存在着过表达，并通过刺激血管生成因子VEGF和减少血管抑制因子TSP1分泌，打破了调控血管生成的平衡，起到诱导血管生成的作用，为肿瘤生长提供条件。

　　【参考文献】

　　[1] Lyden D,Young A Z,Zagzag D, et al. ID1 and ID3 are required for neurogenesis, angiogenesis and vascularization of tumour xenografts[J]. Nature, 1999,401:607677.

　　[2] Forootan S S,Wong Y C,Dodson A, et al. Increased Id1 expression is significantly associated with poor survival of patients with prostate cancer[J]. Hum Pathol, 2007,38(9):13211329.

　　[3] Yuen H F,Chan Y P,Chan K K, et al. Id1 and Id2 are markers for metastasis and prognosis in oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer, 2007,97(10):14091415.

　　[4] Takai N,Miyazaki T,Fujisawa K, et al. Id1 expression is associated with histological grade and invasive behavior in endometrial carcinoma[J]. Cancer Lett, 2001,165(2):185193.

　　[5] 甘继瑶,张 声,马延豪,等. Id1和Id3在原发性胃癌的表达[J]. 福建医科大学学报, 2006,40(5):440442.

　　[6] Kamalian L,Gosney J R,Forootan S S, et al. Increased expression of Id family proteins in small cell lung cancer and its prognostic significance[J]. Clin Cancer Res, 2008,14(8):23182325.

　　[7] Ling M T,Lau T C,Zhou C, et al. Overexpression of Id1 in prostate cancer cells promotes angiogenesis through the activation of vascular endothelial growth factor (VEGF)[J]. Carcinogenesis, 2005,26(10):16681676.

　　[8] Sakurai D,Tsuchiya N,Yamaguchi A, et al. Crucial role of inhibitor of DNA binding/differentiation in the vascular endothelial growth factorinduced activation and angiogenic processes of human endothelial cells[J]. J Immunol, 2004,173(9):58015809.

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