Id-1在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义

【摘要】  目的 经过检测宫颈癌及其癌前病变组织中DNA分离抑止因子-1(Id-1)蛋白和mRNA的表达状况，讨论Id-1在宫颈癌变过程中的作用。办法 采用免疫组化SP法检测Id-1蛋白在15例慢性宫颈炎、17例CINⅠ、25例CINⅡ～Ⅲ和79例宫颈癌组织中的表达;采用实时荧光定量RT-PCR法检测Id-1 mRNA在10例慢性宫颈炎、8例CINⅠ、9例CINⅡ～Ⅲ和8例宫颈癌组织中的表达。结果 慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组织中Id-1蛋白表达阳性率呈逐步升高趋向(P<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%;CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，随宫颈癌变水平加重Id-1基因表达增加(P<0.05)。结论 随着宫颈癌变水平加重，Id-1表达逐步增加，标明Id-1可能参与了宫颈癌的发病机制。

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【关键词】  宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;Id-1;DNA分离抑止因子-1;实时荧光定量RT-PCR

　[Abstract] Objective To investigate the effect of the inhibitor of DNA binding-1(Id-1)in the process of carcinogenesis of cervical cancer by detecting the expression of Id-1 protein and mRNA in the cervical cancer and its precancerous lesions.Methods The expressions of Id-1 protein in 15 chronic cervicitis, 17 CINⅠ, 25 CINⅡ-Ⅲ and 79 cervical squamous cancers were assessed by immunohistochemical SP methods. Real-time fluorescence quantitative RT-PCR (QRT-PCR) was used to detect the expression level of Id-1 mRNA in 10 chronic cervicitis, 8 CINⅠ, 9 CINⅡ-Ⅲ and 8 cervical squamous cancers respectively.Results It was found that the expression level of Id-1 protein followed this pattern: cervical cancer > CINⅡ-Ⅲ > CINⅠ> chronic cervicitis (P<0.01), and the positive expression rate of Id-1 protein was 74.7%, 40.0%, 11.8%and 0.0% respectively. The relative amount of Id-1 mRNA expression in CINⅠ, CINⅡ-Ⅲ and cervical cancer is respectively 1.34 times, 3.42 times and 10.37 times of that in the chronic cervicitis, which indicates that the Id-1 mRNA expression increases with the proceeding of cervical affection.Conclusion The Id-1 expression was increased with the aggravation of cervical lesions. It suggests that Id-1 might have participated in the pathogenesis of cervical squamous cell carcinoma.

　　[Key words] cervical cancer; CIN; Id-1; inhibitor of DNA binding-1; real-time fluorescence quantitative RT-PCR

　　近年研讨发现，DNA分离抑止因子-1(Id-1)作为一种转录调理因子在多种上皮来源的恶性肿瘤中表达升高，并且与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成等有关[1]。目前对Id因子与宫颈癌的相关研讨国内外仅见一篇报道，即Schindl等[2]的研讨，但对Id-1在宫颈癌变过程(慢性宫颈炎CINⅠCINⅡ～Ⅲ→宫颈癌)中的研讨尚未见报道。为此笔者采用免疫组化SP法和实时荧光定量RT-PCR法，初次定性与定量研讨Id-1蛋白和mRNA在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中的表达，初步讨论Id-1在宫颈癌发作开展中的作用及意义，为宫颈癌的病因学研讨和基因靶向治疗提供一个新线索。

　　1 资料与办法

　　1.1 研讨对象

　　1.1.1 免疫组化

　　选取我院病文科保管的2004-2009年宫颈癌变相关组织石蜡标本136例，患者年龄23～68岁，均匀(42.56±8.20)岁。根据病理表现分四组，即慢性宫颈炎组15例、CINⅠ组17例、CINⅡ～Ⅲ组25例、宫颈癌组79例。一切标本均由≥2名的病理学专家再次阅片确诊。选定的石蜡标本均经中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。

　　1.1.2 实时荧光定量RT-PCR

　　经伦理委员会批准并获得患者知情同意后，选取2008年10月-2009年10月在我院行宫颈活检或子宫切除术的患者作为本研讨对象。一切患者术前均未承受放、化疗或手术治疗。所取新颖组织标本大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm，液氮保管备用。最后依据病理结果归入慢性宫颈炎组10例、CINⅠ组8例、CINⅡ～Ⅲ组9例、宫颈癌组8例，共35例，年龄26～57岁，中位年龄37岁。阳性对照为卵巢癌1例，年龄55岁。

　　1.2 实验办法

　　1.2.1 免疫组化SP法检测Id-1蛋白的表达

　　(1)一抗Id-1兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化SP超敏试剂盒为天津津脉基因测绘技术有限公司产品。详细实验步骤依照阐明书停止。以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照，阳性对照由Santa Cruz公司提供。(2)采用Olympus光学显微镜察看各实验组宫颈组织中Id-1表达状况，由2名实验人员双盲法独立分别对实验结果停止半定量评分，最终结果取均值或协商肯定。Id-1免疫组化阳性着色主要定位于胞浆，为棕黄色或棕褐色。依据着色深浅和阳性细胞比例对免疫组化结果停止半定量评分，肯定表达强度分级。详细评分规范见参考文献[2]。

　　1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测Id-1 mRNA的表达

　　(1)Trizol提取组织总RNA，-70℃保管备用。(2)Id-1和β-actin基因引物和TaqMan探针由TaKaRa公司合成，见表1。(3)Id-1基由于单外显子，逆转录前用DNA酶处置。依照Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(立陶宛MBI 公司)阐明书停止操作，逆转录取得cDNA。逆转录条件为20℃ 10min → 42℃ 60min → 70℃ 10min，-20℃保管备用。(4)规范曲线的制备：用假定初始拷贝数(X)的cDNA模板按10倍梯度停止稀释，自每个稀释模板中取样2μl，分别参加30μl的反响体系中行实时荧光定量RT-PCR。扩增条件为94℃预变性2min;94℃ 20s，54℃(Id-1)/52℃(β-actin)20s，60℃ 30s，45个循环;最后60℃延伸5min。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反响的延伸期，在该时相读取Ct值。(5)待测样本目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的cDNA样品各取2μl，参加和上面完整相同的反响体系，在同样的反响条件下行PCR扩增，测定各样品的Ct值，采用比拟阈值法计算目的基因拷贝数=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(CtId-1-Ctβ-actin)实验组-(CtId-1-Ctβ-actin)参照组。本研讨目的基由于Id-1，管家基由于β-actin，参照组为慢性宫颈炎组。2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相关于参照组的变化倍数。表1 Id-1和β-actin基因引物及探针序列

　　1.3 统计学剖析 应用SPSS13.0软件系统对所得数据停止统计学处置，检验水准取双侧α=0.05。统计办法包括χ2检验、单向方差剖析(One-way ANOVA)。

　　2 结果

　　2.1 Id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 慢性宫颈炎组织中未见Id-1蛋白阳性表达，而宫颈癌及癌前病变组织中均有不同水平的Id-1免疫阳性反响，主要定位于细胞质，表现为棕黄色或黄色颗粒样物质。Id-1表达阳性率随宫颈癌病变水平的加重而升高，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1阳性表达率分别为0、11.8%、40.0%和74.7%，差别有统计学意义(χ2=45.017，P=0.000)。见表2、图1。表2 Id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达程度

　　2.2 Id-1 mRNA在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 见表3。对36例组织标本停止实时荧光定量RT-PCR检测，得规范曲线回归系数均>0.96，规范曲线拟合称心。Id-1基因扩增效率为1.97，β-actin为1.99。可见，目的基因与管家基因的扩增效率根本相同，故可采用比拟阈值法计算Id-1基因拷贝数。CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别为慢性宫颈炎组的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差别有统计学意义(P=0.003)，Id-1基因表达在宫颈癌组高于癌前病变组(P<0.05)，而在慢性宫颈炎组织中的表达低于宫颈癌(P=0.031)和CINⅡ～Ⅲ组织(P=0.045)。可见，随宫颈癌变水平加重Id-1基因表达增加。图1 宫颈癌及其癌前病变组织中Id-1蛋白的表达状况表3 Id-1 mRNA在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达

　　3 讨论

　　3.1 Id-1的构造与功用 Id-1是分化和(或)DNA分离抑止因子(inhibitor of differentiation and/or DNA binding，Id)家族成员之一，Id因子是1990年由Benezra等[3]首先从小鼠红白血病(murine erythro-leukemia，MEL) 细胞 cDNA文库中克隆出来的。Id因子属于HLH转录因子，也是迄今为止发现的唯一具有负性调控HLH基因家族功用的调控蛋白。HLH蛋白是一类具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)构造域的DNA分离蛋白，Id因子可经过HLH构造中的α-螺旋互相作用与其他HLH家族转录因子(主要为bHLH类转录因子)分离构成二聚体，但因其构造内缺乏碱性残基区使得这种二聚体无法有效地分离到DNA上，不能发挥转录因子活性，从而抑止相关基因转录，产生生物学效应。在哺乳动物细胞中已发现4种Id因子，即Id-1～Id-4。目前对Id-1的研讨最多，发现其参与细胞分化调控、抑止肿瘤细胞凋亡、诱导细胞永生化、促进肿瘤血管生成等[1，4，5]，在癌症发作开展中起重要作用。而且Id-1在许多上皮来源的肿瘤，如食道鳞状上皮癌[6]、子宫内膜癌[7，8]、肺癌[9]、胃癌等均有高表达，揣测Id-1可能参与了这类上皮源性肿瘤的发作。

　　3.2 Id-1在宫颈癌变过程中的作用 目前，关于Id-1在宫颈癌变过程中表达状况的研讨国内外尚无相关报道。仅Schindl等[2]应用免疫组化办法研讨发现早期宫颈癌中有Id-1高表达，表达阳性率为79.2%。分别采用免疫组化SP法和实时荧光定量RT-PCR从蛋白和基因程度检测了慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组织中Id-1的表达状况。免疫组化结果显现， Id-1表达阳性率与宫颈癌病变水平亲密相关，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌组织中Id-1蛋白表达阳性率呈逐步升高趋向(P<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%，而且Id-1的染色强度也随病变加重而加深，一切的宫颈癌及其癌前病变组织中均呈现不同水平的Id-1免疫阳性反响;实时荧光定量RT-PCR检测结果也从基因程度进一步证明了免疫组化的结论，即Id-1mRNA的表达也随宫颈癌变水平加重而增加，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈鳞癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差别有统计学意义(P<0.05)。综上结果提示Id-1过表达参与了宫颈癌的癌变过程，在宫颈癌的发病机制中可能起到了重要作用，但详细致癌机制有待进一步研讨说明。

　　盛行病学和分子病毒学已有相当多材料证明，人乳头状瘤病毒(HPV)极有可能是宫颈癌的一个主要病因[10]。在持续HPV感染的根底上，由慢性宫颈炎CINⅠCINⅡ～Ⅲ→宫颈浸润癌可能是大多数宫颈鳞癌的发病过程。但HPV感染并不能完整解释宫颈癌的发作，比方，前瞻性研讨发现宫颈感染HPV16/18型者在1年内只要1/3开展为CIN，以后也仅约15%将开展为宫颈癌，其他大局部均自行衰退。可见宫颈癌的发作机制中，还存在其他HPV协同要素起重要作用。本研讨结果初步显现了转录调理因子Id-1与宫颈鳞状上皮癌变停顿有关，揣测在HPV持续感染的根底上，Id-1可能与HPV E6/E7癌基因协同作用参与了宫颈鳞癌的发病机制，促进了宫颈癌变的持续恶性停顿，但尚需更深化的研讨证明。

　　细胞分化受阻惹起无限增殖，招致细胞永生化是体外培育细胞恶性转化过程的第一步，也是体内肿瘤发作与开展进程的早期阶段。大量实验结果标明，Id-1具有“永生化”癌基因的某些特性[11]，如抑止细胞分化、惹起细胞持续增殖及血管持续重生等。Id-1被以为是致癌性转化的一个重要调理因子。Tang等[12]研讨发现，KSHV(卡波济肉瘤相关病毒) 感染人内皮细胞可诱导Id-1表达增加，且内皮细胞增殖加快，提示Id-l表达上调可能是细胞恶性转化的重要步骤。外源性表达Id-1可经过抑止p16INK4a/Rb和p53途径使细胞永生化，促进细胞不时增殖，最终构成肿瘤[4]。有研讨显现，同时转染Id-1和抗凋亡因子Bcl-2可诱导成纤维细胞永生化[13]，仅Id-1持续表达就可使皮肤上皮细胞的端粒酶活化，进而招致细胞永生化[4]。此外，Id-1能够经过激活NF-κB途径抑止肿瘤细胞凋亡，经过激活MAPK途径诱导癌细胞增生，促进肿瘤发作。Ling等[15]的研讨发现，经过基因转染上调前列腺癌LNCaP细胞Id-1的表达，可加强NF-κB的反式激活及核转移，同时伴有下游效应因子Bcl-xL和ICAM-1的表达上调，使肿瘤细胞凋亡遭到抑止;而用反义寡核苷酸技术抑止Id-1表达可抑止NF-κB的激活，使细胞对TNF-α诱导的凋亡敏感。在前列腺癌细胞LNCaP中Id-1 的霎时表达和稳定表达增加均可活化Raf/MEK1/2信号途径使癌细胞增殖明显加速，而当用MEK1/2抑止剂PD098059阻断Raf/MEK1/2信号途径后，细胞周期S期的有丝团结受抑止，细胞生长速度减慢，提示MAPK信号途径的活化在Id-1诱导的前列腺癌细胞增殖中起重要作用[16]。

　　总之，本研讨结果标明Id-1在宫颈癌发作开展中起重要作用，靶向抑止Id-1基因表达可能给宫颈癌的治疗带来新的希望。深化研讨Id-1在宫颈癌发病机制中的作用对宫颈癌的防治研讨有重要意义。

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