OATPC分子阳离子赖氨酸49突变体削弱其底物摄取能力

【摘要】  目的 研讨人肝脏特异的有机阴离子转运蛋白基因OATPC分子膜外区激进的49位阳离子赖氨酸，对其有机阴离子底物摄取才能的影响。办法 从人肝脏mRNA中克隆OATPC野生型基因全长cDNA序列，经过定点突变将高度激进的第49位赖氨酸残基突变为中性氨基酸苏氨酸，构建其C端的GFP交融蛋白的真核表达载体，转染HEK293细胞，察看突变体的细胞膜定位才能及底物摄取功用的变化。结果 OATPC野生型及突变体基因均能定位表达于HEK293细胞质膜；［3H］硫酸盐雌酮底物摄取实验显现，突变体5 min底物摄取量较野生型降落74.18%，浓度依赖的［3H］硫酸盐雌酮底物摄取动力学剖析标明，突变体Km增高和vmax降低。结论 OATPC蛋白膜外区第49位赖氨酸是其关键的功用氨基酸，是其重要的功用构造单位。

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【关键词】  OATPC； 定点突变； 底物摄取； HEK293细胞

      Mutant of OATPC positive ion lysine49 impairs uptaking ability of its substrate    YANG Cong*, CHEN Wensheng, DENG Guohong, WANG Rongquan, XIAO Tianli.* Institute of Digestive Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    Corresponding author: CHEN Wensheng, Email: wenshengchen@hotmail.com

    【Abstract】  Objective  To investigate the effect of the mutant of organic anion transporting polypeptideC (OATPC) positive ion lysine49 localized on the polypeptide extracellular loop in impairing uptaking ability of its substrate. Methods   Full length cDNA of the wild type OATPC was cloned from human liver mRNA by RTPCR. Then, the highly conserved lysine49 residues were mutated to threonine by sitedirected mutagenesis technique to construct the eukaryotic expression vectors of C terminal GFP fusion protein. Targeting ability and its uptaking substrate capability of cell plasma membrane were observed by transfecting those constructs into HEK293 cells. Results  Both wildtype OATPC protein and mutant were highly expressed on HEK293 cell plasma membrane. ［3H］ estrone sulfate substrate uptaking technique showed that the amount of substrate uptaken by mutant at 5 min had decreased by 74.18%, compared with the wild type OATPC protein. ［3H］ estrone sulfate substrate uptaking dynamics demonstrated that Km value increased but V max decreased in the mutant. Conclusion  The conserved positive ion lysine49 on extracellular loop of OATPC may be a determinant amino acid in uptaking organic anion substrates.

    【Key words】  OATPC;  Sitedirected mutagenesis;  Substrate uptake;  HEK293 cell

    OATPC(organic anion transporting polypeptideC)(SLC21A6)是人肝脏中特异性表达的有机阴离子转运多肽， 是OATPs大家族的重要成员。它散布在窦状间隙肝细胞基底侧膜上，参与肝脏摄取多种内源性和外源性有机溶质(如胆红素、某些药物和外源性有机毒素等)。相关研讨发现来源于2亿年前的一种古老的海洋鱼类低等脊椎动物——多髦毛小“鳐”的肝脏，存在鼠和人等类似的有机阴离子转运系统，并克隆得到了一个在肝脏组织中特异性高表达的、原始的sOatp基因［1］。进一步比照“鳐”肝脏特异的sOatp和人肝特异性的OATPC分子的高同源性区域，分离其有机阴离子底物转运特性，发现OATPC分子膜外区第49位赖氨酸是高度激进的阳离子氨基酸。揣测其与OATPC分子有机阴离子底物摄取功用亲密相关，可能是关键的氨基酸基团。为考证此假说，我们从人肝脏mRNA中克隆OATPC全长cDNA序列，经过定点突变将第49位赖氨酸(阳离子氨基酸)突变为中性氨基酸苏氨酸，构建其C端的GFP交融蛋白的真核表达载体，实验察看野生型和突变体的细胞膜定位及底物摄取功用变化，以提醒OATPC转运多肽对有机阴离子底物的选择性转运的分子作用机制。

    1  资料与办法

    1.1  资料

    反转录试剂盒、定点突变试剂盒购自Stratagene公司；pcDNA3.1、lipofectamine 2000、mRNA抽提试剂盒Trizol、Topo cloning试剂盒购自Invitrogen公司；放射性底物［3H］硫酸盐雌酮购自PerkinElmer Life Sciences公司；一切抗体(antiOATPC，antiCalnexin)均购自Santa Cruz公司。

    1.2  办法

    1.2.1  OATPC基因克隆及其野生型(wide type,Wt)和C端GFP野生交融型基因真核表达载体的构建：用Trizol试剂盒重新鲜人肝组织中抽提别离得到完好的mRNA，反转录为cDNA，设计其特异的Oligo引物ATCTATATTTCAATCATGGACCAAAATC，GACAATGTGTTTCACTATCTGCCCC以及终止密码突变引物TTGGAAACACAGAAGCAGAAGTGGC，经PCR扩增出OATPC全长cDNA(野生型和终止密码突变体)，经过Topo cloning技术自动衔接装载入pCR2.1和pcDNAGFP载体，得到pCR2.1OATPC野生型质粒和pcDNAOATPCGFP野生交融型基因真核表达质粒。经DNA序列测定审定整个基因序列的正确性后，将OATPC野生型基因从pCR2.1OATPC野生型质粒中酶切后，转装到pcDNA3.1真核表达质粒中，得到不含GFP交融蛋白的pcDNA3.1OATPC野生型真核表达质粒。

    1.2.2  对pcDNAOATPCGFP野生交融型基因膜外激进区第49位赖氨酸停止定点突变：用定点突变试剂盒将pcDNAOATPCGFP(Wt)交融基因定点突变；突变体(mutation,Mut)：49 Lys(K)→Thr(T)(AAA→ACA)；突变引物为：5′GACACTAGGTGCAATTATTATGACAAGTTCCATCATTCATATAGAACGG3′。突变后经测序证明胜利突变为苏氨酸。

    1.2.3  Wt及Mut在HEK293细胞中表达后的细胞定位才能检测：将经多聚赖氨酸处置的2.0 cm×2.0 cm盖玻片放入6孔细胞培育板中，HEK293细胞按3.0×106/孔种植，用含10%胎牛血清的高糖DMEM(Hyclone)培育，待细胞生长铺底约60%时停止转染，将Wt及Mut用脂质体法转染HEK293细胞，转染2 h后经4%多聚甲醛固定,以野生交融型蛋白为阳性对照，共聚焦显微镜下察看OATPCGFP突变体的细胞膜上的定位状况。

    1.2.4  Western印迹检测细胞总蛋白和膜蛋白中OATPC和Calnexin蛋白的表达：分别取细胞总蛋白20 μg或膜蛋白100 μg与等体积上样缓冲液混匀，直接上样，蛋白运用7.5% SDSPAGE电泳胶停止电泳别离，然后电转移至硝酸纤维素膜，丽春红染色肯定上样的均一性和电转移效率，含1%脱脂奶粉的PBST室温封锁2 h，加一抗(1∶100)室温孵育过夜，用PBST洗去一抗后参加相应二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h。OATPC免疫印迹所用的同一硝酸纤维素膜上免疫复合物经洗脱以后，再与另一胞质蛋白Calnexin抗体孵育后，Western印迹检测OATPC和内参照Calnexin蛋白表达量。

    1.2.5  Wt和Mut交融蛋白在HEK293细胞对底物［3H］硫酸盐雌酮摄取功用实验：HEK293细胞按2.0×106/孔种植于经多聚赖氨酸铺底处置的12孔细胞培育板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM(Hyclone)培育细胞，待细胞生长铺底约80%～90%时停止脂质体法瞬时转染细胞，在转染24 h后，每孔细胞用DMEM(Hepes，25 mmol/L)1.0 ml漂洗1次，然后每孔参加含1.0 μl［3H］硫酸盐雌酮的DMEM(Hepes，25 mmol/L)200 μl，分别在0、5 min后在0 ℃(冰上)用DMEM(5%BSA，Sigma)400 μl漂洗1次，再用DMEM(Hyclone)400 μl漂洗3次；每孔参加1%SDS 100 μl裂解细胞，取局部细胞裂解液做液闪测定3H放射量，余下的细胞裂解液离心取上清测定蛋白浓度。另外，每孔参加200 μl不同浓度的［3H］硫酸盐雌酮溶液停止浓度依赖摄取实验，5 min后在0 ℃(冰上)DMEM(5%BSA，Sigma)400 μl漂洗1次，再用DMEM(Hyclone)400 μl漂洗3次；每孔参加1%SDS 100μl裂解细胞，取局部细胞裂解液做液闪测定3H放射量，余下的细胞裂解液离心取上清测定蛋白浓度。计算Wt、Mut两种交融蛋白对不同浓度［3H］硫酸盐雌酮的摄取量，运用米式方程作出摄取动力参数图，分别计算出Km值、vmax值。

    1.3  统计学剖析

    数据用±s的方式表示，用SPSS 10.0统计学剖析软件t检验对各组数据停止剖析，比拟各组间的差别。P<0.05为差别有统计学意义。

    2  结果

    2.1  Wt和Mut的亚细胞定位

    应用激光共聚焦显微镜在HEK293细胞爬片质粒转染后24 h后察看细胞，细胞核经4′，6二脒基2苯基吲哚染色为蓝色，见图1、2。

    图1  野生型激光共聚焦显微镜察看结果

    图2  突变体激光共聚焦显微镜察看结果

    从图1我们能够看出：Wt的绿色荧光主要定位在细胞膜上，在胞质和胞核中的绿色荧光很少，阐明了野生型具有在HEK293细胞上有良好的细胞膜定位才能，是可以充沛在其胞膜上定位的。这也是发挥OATPC蛋白质摄取功用的根底。而从图2能够看出：Mut的绿色荧光也可以定位在HEK293细胞的胞膜上，但在其胞质中也可见较多的绿色荧光，阐明了突变体蛋白在HEK293细胞膜定位才能与野生交融型相比可能有削弱。

    2.2  Wt和Mut蛋白在HEK293细胞膜的表达

    别离转染OATPCGFP交融蛋白基因(Wt和Mut)的HEK293细胞总蛋白和膜蛋白，分别以Western印迹检测OATPC和内参照胞质蛋白Calnexin表达量(图3)，结果显现Wt和Mut的OATPCGFP蛋白的表达量无明显差别。

    图3  Western印迹检测HEK293细胞总蛋白、膜蛋白中野生型和突变体OATPCGFP蛋白表达量(以胞质蛋白Calnexin为内参照)

    2.3  Wt和Mut的5 min底物摄取量及动力学参数Km和vmax值

    采用3个同样的对照孔停止实验，分别测定每一孔的放射量和蛋白浓度，经过换算来得到其摄取量，结果见图4。

    图4  0、5 min［3H］硫酸盐雌酮摄取结果

    从图4我们能够看出与野生交融型相比拟，突变交融型对硫酸盐雌酮摄取才能明显削弱，在5 min的摄取量降落了74.18%，两者经t检验，P<0.01，差别有统计学意义。我们进一步用不同浓度的［3H］硫酸盐雌酮停止摄取实验，得出各自的摄取动力曲线(图5)，并对两者的Km和vmax分别停止t检验，P<0.01。也阐明了Mut对［3H］硫酸盐雌酮的摄取才能是明显降低的。

    图5  野生型和突变体动力曲线

    3  讨论

    肝脏是维持人体正常机能的重要器官。其主要功用之一是从门静脉血液中摄取一些毒性的有机化合物，在肝细胞中加工、转化、代谢，再分泌到胆汁中，流经肠道随粪便扫除体外，从而避免毒性物质在体内的汇集，发挥其解毒作用。肝脏摄取有机化合物溶质的功用在很大水平上主要由肝细胞膜上一组构造和功用类似的转运蛋白质介导，即有机阴离子转运多肽OATPs［2］。OATPC是仅在人肝脏组织中特异性表达的有机阴离子转运蛋白，是参与肝脏从血液中摄取、肃清多种内源性和外源性有机溶质的重要膜蛋白［3］。已有的研讨显现，OATPC对药物的转运是影响肝脏药物代谢的重要环节，有研讨发现OATPC对在肝脏转化灭活药物的代谢特别重要，如新型他汀类降血脂药物普伐他汀［4-5］的代谢主要经肝细胞转运摄取、排泄肃清，OATPC是其在肝细胞内摄入代谢的主要载体。抗结核药物利福霉素SV和利福霉素的临床治疗常可诱导患者呈现高胆红素血症以及溴磺酚BSP肃清率降低等肝功用损伤的反作用，与这类药物抑止OATPC的活性有关［6］。OATPC参与非分离型胆红素的转运，其活性的减低可能与遗传性家族性非分离胆红素血症Gilbert综合征有关［7］。因而，研讨其转运分子机制关于说明家族性黄疸的发病机制、药物和毒素在肝脏的摄取转运过程具有重要的临床意义。

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    本研讨中，我们发现OATPC分子第49位氨基酸是高度激进的阳离子氨基酸。在对美国非洲裔和欧洲裔人群调查的研讨中发现，OATPC基因的单个碱基突变、特别是发作于激进区的突变能够直接严重削弱它的摄取功用，少数突变是经过影响其在细胞内表达后的细胞膜定位而间接削弱其功用，而同源性较低的区域的突变对其功用影响很小或以至没有影响［8］。而OATPC分子第49位氨基酸为高度激进的阳离子氨基酸，我们揣测可能与其有机阴离子底物摄取功用亲密相关。HEK293细胞是来源于人胚胎肾皮质的细胞系 ，具有生长速度快，倍增时间短，生物学性质稳定和易于转染基因的特性，并且其无内源性的OATPC的表达，因此选为实验转染细胞。

    结果标明，第49位阳离子氨基酸赖氨酸突变为中性氨基酸苏氨酸后，从激光共聚焦图片能够看出在细胞膜的定位才能上野生型和突变体都可以在细胞膜上正肯定位，但突变体除了在细胞膜上有表达外，与野生型相比在胞质中也似有较多表达。阐明突变体的细胞膜定位才能与野生型相比可能是削弱的。固然Western印迹检测结果显现Wt和Mut的OATPCGFP蛋白的表达量无明显差别，但从对底物的摄取才能来看，OATPC野生型对［3H］硫酸盐雌酮的摄取才能很高，而突变体对硫酸盐雌酮的摄取才能比拟低，两者的Km和vmax阐明野生型比突变体对硫酸盐雌酮具有更高的亲和力和更大的最大速度，经t检验，P<0.01，差别有统计学意义，阐明突变体功用明显削弱。因而，我们以为第49位阳离子氨基酸赖氨酸突变为中性氨基酸苏氨酸后的OATPC的底物摄取才能显著降低。这可能与突变后的OATPC在细胞膜上的定位才能降落有关，但更有可能是由于阳离子氨基酸突变为中性氨基酸后，降低或者局部失去了对有机阴离子底物硫酸盐雌酮的分离、转运才能。

    经过本研讨我们以为OATPC分子的第49位阳离子氨基酸赖氨酸是OATPC分子重要的功用构造单位，对维持OATPC分子转运功用十分重要。

【参考文献】
  ［1］ Cai S Y, Wang W, Soroka C J, et al. An evolutionarily ancient Oatp: insights into conserved functional domains of these proteins. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,282(4):G702-710.

［2］ Meier P J, Stieger B. Bile salt transporters. Annu Rev Physiol,2002,64:635-61.

［3］ KullakUblick G A, Stieger B, Meier P J. Enterohepatic bile salt transporters in normal physiology and liver disease. Gastroenterology,2004,126(1):322-342.

［4］ Niemi M, Schaeffeler E, Lang T, et al. High plasma pravastatin concentrations are associated with single nucleotide polymorphisms and haplotypes of organic anion transporting polypeptideC (OATPC, SLCO1B1). Pharmac Ogen Etis,2004,14(7):429-440.

［5］ Mwinyi J, Johne A, Bauer S, et al. Evidence for inverse effects of OATPC (SLC21A6) 5 and 1b haplotypes on pravastatin kinetics. Clin Pharmacol Ther,2004,75(5):415-421.

［6］ Vavricka S R, Van Montfoort J, Ha H R, et al. Interactions of rifamycin SV and rifampicin with organic anion uptake systems of human liver. Hepatology,2002,36(1):164-172.

［7］ Cui Y, Konig J, Leier I, et al. Hepatic uptake of bilirubin and its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6. J Biol Chem,2001,276(13):9626-9630.

［8］ Tirona R G, Leake B F, Merino G, et al. Polymorphisms in OATPC: identification of multiple allelic variants associated with altered transport activity among European and AfricanAmericans. J Biol Chem,2001,276(38):35669-35675.