PCR-STR技术在双生子卵型鉴定中的应用-医学论文发表网
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【关键词】 STR；双生子；卵型审定
Use of PCR-STR technique in zygosity diagnosis of twins
WANG Lin，WANG Yi，MA Xu.Peking Union Medical College，Beijing 100081，China
［Abstract］ Objective To explore whether PCR-STR technique is must or not in zygosity diagnosis of twins.Methods 15 STR were genotyped in five twin’s family.The 15 STR were D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，VWA，D8S1179，TPOX，FGA，Penta E and Penta D.Record the genotype result and calculate the combined paternity index (CPI).Results The PI of five twin’s family were all above 10 000，which is the threshold of paternity tesing.There are 4 DZ，and 2 MZ.Two of them were disputed with traditional method.Conclusion PCR-STR technique not noly can be used in paternity testing，but also in zygosity diagnosis of twins.Compared with traditional methods，PCR-STR has the most accurate result.We recommend that PCR-STR should be used in twins study.
［Key words］ STR；twins；zygosity diagnosis of twins
双生子分同卵双生和异卵双生两种。同卵双生（monozygotic twin，MZ）是受精卵在第一次卵裂后，每个子细胞各发育成一个胚胎，故它们的性别相同，遗传特性及表型特征也根本相同，由于同卵双生有完整相同的先天遗传背景，所以在对同卵双生子的研讨中，可扫除遗传要素的影响，从而有利于对各种疾病与证候的研讨。异卵双生（dizygotic twin，DZ），来源于两个卵子分别与精子受精而发育成的两个胚胎，故其性别不一定相同，异卵双生子具有相同的遗传基因型的概率（只要25%或更少），遗传特征及表型仅有某些类似。由于普通双生子具有相同的生长环境，所以在对异卵双生子的研讨中，可扫除环境的影响。双生子研讨有利于在同一个平台上理解遗传要素和环境要素在一种性状与证候中占多大比例，对双生子的研讨具有重要的理论价值和理想意义。
依据双生子的性别、胎膜和胎盘关系可初步鉴别双生子的类型［1］，但上述指标尚不够准确，如双生子的性别不同，可肯定是异卵双生；双生子性别相同时，假如胎膜和胎盘是独立的两套，可能是异卵双生，也可能是同卵双生。当用上述指标不能准确鉴别时，需求进一步求助其他客观指标或标志如指纹、智力、皮纹等11项指标，该办法是目前快捷、便当、常用的办法。与皮纹、血型等遗传表型标志相比，遗传物质DNA多态标志具有更多的优越性。近年来，有条件的实验室曾经不再运用遗传表型标志来停止个体辨认。因而本文将目前常规的个体辨认技术应用到双生子的卵型审定，比拟该技术与传统技术的技术可及性和有效性。
1 对象与办法
1.1 研讨对象 2004年3月至2008年7月来本实验室参与亲子审定的双亲家庭双生子2对，单亲家庭双生子4对，均自愿参与审定，双生子年龄3个月~20岁。检材为外周静脉抗凝血1 ml或口腔拭子。
1.2 办法 常规提取Chelex-100法提取DNA。短串联反复序列（short tandem repeat，STR）试剂盒扩增15个基因座，包括D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、VWA、D8S1179、TPOX、FGA等13个CODIS基因座以及Penta E、Penta D基因座，扩增在ABI 2400热循环仪（Applied Biosystems，美国）上停止。采用ABI Prism 310遗传剖析仪（Applied Biosystems，美国）停止自动激光荧光毛细管电泳检测分型。毛细管检测长度47 cm，POP-4胶。运用GeneMapper软件肯定扩增片段长度和样本的基因分型。
2 结果
2.1 卵型审定结果 见表1。6对双生子中同卵双生2对，异卵双生4对。其中D-02在D18S51基因座呈现与其父不契合基因型，其父为21/21，D-02为15/20，经追加D18S1364等9个基因座后肯定为STR突变。表1 6对双生子根本状况和卵型审定结果汇总
2.2 CPI计算 3对双生子家庭的父亲、母亲，3对双生子家庭的父亲均自愿参与了审定，亲权指数的计算公式参照文献［1］。一切家庭累计亲权指数均大于10 000，不能够扫除亲缘关系。
3 讨论
3.2 双生子卵型审定办法 如前所述，展开双生子研讨的前提是辨别双生子的卵型。双生子的卵型审定的办法有以下几种办法［2］。
3.2.1 移植法 即依据双生子间关于互相移植组织的相容性的鉴别办法。常用的移植组织是皮肤，假如供体和受体的基因型不同，则移植的皮肤将因组织不相容性而被排挤，因此阐明该双生子为异卵双生子。相反的为单卵双生子由于基因型完整相同，表达根本相同的组织抗原，因此移植物不发作排挤现象。该法的结果比拟牢靠，但皮肤移植实验有一定创伤性，临床可承受性较差。
3.2.2 胎膜法 即依据双生子的胎膜构造停止鉴别的办法。先判别双生子的性别，假如双生子的性别不同，可肯定是异卵双生；双生子性别相同时，假如胎膜和胎盘是独立的两套，可能是异卵双生，也可能是异卵双生。异卵双生子普通具有两个胎盘，少数具有结合胎盘，结合胎盘的胎膜膈由两层绒毛膜和两层羊膜组成；单卵双生子只要单个胎盘，胎膜膈仅由两层羊膜组成，少数能够无羊膜膈。该审定办法的有一定误差，且必需在分娩当时才干鉴别，在运用上有一定的局限性。本文研讨中的第一例A-03/A-04个体在母亲妊娠时B超显现一个胎盘，医生和孕妇自己均以为是同卵双生妊娠，孩子在出生后在肤色等表型方面显现差别。亲子审定和卵型审定的结果最终显现A-03和A-04均是母亲的亲生后代且为异卵双生子。妊娠时所察看到的一个胎盘可能是由两层绒毛膜和两层羊膜组成的结合胎盘。
3.2.3 类似法 即应用终身不变而又互相独立的人类学指标，在双生子间停止类似性的比拟的鉴别办法。早年应用的指标有皮肤纹理、发色、虹膜颜色、齿形等普通体表特征，20世纪的80年代，普遍地采用多种免疫学指标，如红细胞血型系统ABO，P，MN，Rh，Xg等抗原、ABH分泌类型及HLA抗原等，因此又称为血型类似法。随着分子遗传学原理和实验技术的研讨停顿，本文所述鉴别办法是采用PCR-STR基因扫描技术检测人体终身不变的DNA短串联反复序列的数目，并按照反复数目的几停止双生子类似性的研讨，是类似法一个新的分支。本审定办法所用生物学检材微量、取材便当无创伤、结果精确牢靠，是目前较为理想的办法。
3.3 国内双生子卵型审定中存在的可能问题 (1)国内大多数研讨采用胎膜法和双生子普通体表特征完成双生子卵型审定，少量文献采用PCR-STR基因扫描法［3，4］。本文仅对6对双生子停止卵型审定传统办法和基因扫描法的比照性研讨，发现2对结果不分歧。形成审定结果偏向是由于传统办法所采用的客观指标如皮纹、发色、五官特征，以至血型等指标是人体的表现型。关于双生子间的个体辨认，应用遗传表型标志作为剖析判别的工具的局限性愈加明显，一切遗传表型标志都是蛋白质类物质，其化学构造很容易在外界要素的作用下遭到破化或失去活性，难以长期保管。关于微量检材中的表型物质，目前的实验技术程度也难于肯定它的存在。此外，在人群中，个体间具有类似表型的时机也很高，很多状况下靠表型的检测无法将2个个体辨别开来。因而，本文引荐在双生子研讨的第一步应当采用基因扫描的办法完成双生子的卵型审定工作，以防止研讨办法的系统误差。(2)固然国内外学者首肯PCR-STR基因扫描法是技术金规范［5］，但是关于STR基因座选择个数和扫描办法的问题还没有达成共同认识。与个体辨认相同，审定所选择的STR系统应当满足系统效能累计扫除概率应≥0.9999。在此统计规范前提下，所选STR的个数和品种能够自行肯定。PCR-STR的结果是用银染的办法还是用基因扫描的办法，固然没有定论，但是笔者以为在实验条件允许的前提下，银染的办法应当逐渐被取代。首先，银染办法工作等，不能大量快速提供结果，不能满足遗传盛行病学海量数据的请求；其次，银染结果需求有经历的技术人员判读，否则错误分型的结果不可防止。即便如此，在特殊基因座基因型的解读中，如THO1 9.3/10杂合型在银染胶中简直是不能被辨认的［6］。从技术开展方向来看，自动化水平高的荧光PCR-STR将成为主流技术。本文采用了契合国内亲子审定技术规范的技术体系完成双生子卵型审定。(3)异卵双生子卵型审定需求留意的一个问题是双生子来源于不同生物学父亲的问题。这一现象早在1978年就被科学家发现，固然该现象不是十分普遍，但是将影响我们的科学研讨的精确性。因而，双生子卵型审定能否需求父亲的参与成为一个问题［7］。此外，在本研讨中D-02个体在D18S51基因座呈现与其父不契合基因型，其父为21/21，D-02为15/20。依据亲子审定规范，追加D18S1364等9个基因座后肯定为D-02个体在D18S51基因座发作了STR单步突变［8］。异卵双生子中一个个体完好地继承了父亲的基因型，而另一个体发作了基因突变。假如生物学父亲不参与卵型审定，我们无法肯定客观事实。因而，笔者以为，双生子所触及的遗传盛行病学研讨的设计应当思索生物学父亲参与这一问题。在双生子注销系统中，按照研讨环境尽可能增加此项扫除条件，由于同母异父的同胞与双生子有截然不同的遗传盛行病学研讨价值。思索到上述要素，本文在审定中都记载和剖析了双生子父亲的遗传信息。
综上所述，PCR-STR基因扫描是双生子卵型审定的理想办法，其合理有效的应用将为遗传盛行病学的研讨带来新的科学积聚。
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