siRNA阻断NFκB信号通路联合5Fu对食管鳞癌细胞周期的影响

【摘要】  目的 应用RNAi技术特异性的抑止NFκB亚单位p65的表达，讨论在食管鳞癌细胞中将NFκB作为基因治疗靶点的价值。办法 将荧光素标志的对照siRNA转染到食管鳞癌细胞中察看转染效率，p65 siRNA转染到EC9706和Eca109细胞中，运用Western blot的办法检测p65 和Cyclin D1蛋白的表达，运用EMSA法检测转染前后p65与DNA分离活性的变化；流式细胞仪检测p65 siRNA与5Fu(327μg/ml)单独或结合应用，对食管鳞癌细胞周期的影响。结果 荧光素标志的siRNA转染食管鳞癌细胞的效率可达90%以上。在转染后的EC9706和Eca109细胞中，p65和Cyclin D1蛋白的表达程度下调； NFκB与DNA的分离活性明显降落；G0/G1期的细胞开端增加，同时S期的细胞逐步减少；当转染p65 siRNA细胞结合运用5Fu时，G0/G1期的细胞明显增加，同时S期的细胞明显减少。结论 p65 siRNA能够特异性的阻断NFκB信号通路，下调NFκB下游基因中细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，标明活化的NFκB信号通路能够成为食管鳞癌基因治疗中一个重要的分子靶点。

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【关键词】  食管鳞癌；NFκB；RNA interference；Cyclin D1

 Effect of siRNAmediated Inhibition of NFκB Combination with 5Fu on Cell Cycle of ESCC Cell Lines

    TIAN Fang1，2，CHAI Yurong3，XU Peirong2，LIU Hongtao2，XUE Lexun2

    1. Department of Pathophysiology, Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China，2. Laboratory for Cell Biology，3. Department of Histology and Embryology

    Corresponding Author：XUE Lexun，Email：xuelx@371.netAbstract：Objective   RNA interference (RNAi) was employed to inhibit the expression of p65 and to evaluate the effects of NFκB signaling pathway as a target for gene therapy in ESCC cell lines. Methods  A fluoresceinlabeled nonspecial siRNA was used to monitor efficiency in EC9706. EC9706 and Eca109 were transfected with 50 nM p65siRNA, p65 and cyclinD1 protein levels were determined using Western Blotting. After transfected with or without p65siRNA at 72h, cells were tested for nuclear activity of NFκB using nuclear extracts by EMSA. ESCC cells were treated with or without p65siRNA, 5Fu or combinations thereof for 48h. The cells were stained with PI and analyzed cell cycle by flow cytometry. Results  A fluoresceinlabeled nonspecial siRNA was used to monitor efficiency in EC9706, demonstrating nearly 90% transfection efficiency. The protein level of p65 and cyclinD1 decreased after transfected with p65siRNA at 72h. And p65siRNA also suppressed the NFκBDNAbinding. p65siRNAtransfected cells showed an increase in the percentage of cells in the G0/G1 phase and a decrease in the percentage of cells in the S phase. While combination with 5Fu, the results were more prominence. Conclusion  p65siRNA inhibits the constitutively active NFκB signaling pathway, and downregulats the expression of cyclinD1. The strong constitutive NFκB signaling pathway in ESCC makes NFκB a target for the development of novel therapeutic strategies.

    Key words：Esophageal squamous cell carcinoma；NFkappaB；RNA interference；Cyclin D1

 食管鳞癌是一种侵袭性很强的肿瘤，它的预后差，临床停顿疾速，多伴有淋巴结转移，且易复发。核因子NFκB (Nuclear Factorkappa B) 是近年来发现的转录调控因子，最常见的方式是由 p50 和p65组成的异源二聚体，在绝大多数静止期的细胞中，NFκB 与其阻抑物IκBα蛋白相分离，以非活性方式存在于细胞质中。许多刺激物能够经过对IκBα的磷酸化而使其降解，使解离的NFκB进入到核内并暴露它的核辨认位点，从而促进靶基因的转录。活化的NFκB信号通路可加强肿瘤细胞对放化疗药物的抵御力，从而产生耐药性。有研讨标明，在许多人类肿瘤中NFκB信号通路的激活在肿瘤的发作开展中起着重要的作用[13]。

    RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制，是目前研讨基因功用强有力的工具之一[4]。RNAi 的功用是由21～23 个碱基长的短双链RNA完成的 ,即siRNA(small interference RNA ,siRNA)，它具有与目的基因互补的序列。目前这一办法被用于体外细胞程度的基因敲除或基因表达抑止,为其成为基因治疗的手腕开拓了宽广的前景。本研讨拟应用RNA干扰技术，运用针对NFκB信号通路中p65的特异性siRNA,察看其对p65表达的抑止作用及结合化疗药5Fu对食管鳞癌EC9706和Eca109细胞周期的影响，讨论将NFκB作为基因治疗靶点的价值。

    1  资料与办法

    1.1  资料

    1.1.1  细胞系及细胞培育  食管癌细胞系Eca109由本室保管，食管癌细胞系 EC9706由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研讨所分子肿瘤学国度重点实验室惠赠。两株细胞在含有10%的胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的1640培育液（Gibco公司）中于37 ℃、5% CO2 的条件下培育，实验细胞均处于对数生长期。

    1.1.2  抗体和试剂  鼠抗人p65（sc8008）单克隆抗体和兔抗人Cyclin D1（sc753）购自Santa Cruz Biotechnology 公司；细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒、生物素3′末端标志试剂盒（89818）、化学发光EMSA 试剂盒（78833）均购自 Pierce 公司。NFκB p65 siRNA干扰试剂盒购自Cell Signaling Technology公司，碘化吡啶PI购自美国Sigma公司。

    1.2  办法

    1.2.1  siRNA的转染及效率检测  依照Cell Signaling Technology公司siRNA干扰试剂盒阐明书的请求，停止转染。在转染前，EC9706(5×104) 和Eca109(6×104)按一定细胞数铺于6孔板中，运用无抗生素的培育基培育24h。将含有siRNA的转染试剂或荧光素标志的对照siRNA与细胞共孵育5h后，参加新颖培育基孵育24h。用日本Nikon公司显微荧光摄像/照相系统检测荧光素标志的对照siRNA在EC9706细胞中的转染效率并照相。

    1.2.2  胞浆、胞核蛋白的制备  依照细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒阐明书，分别提取细胞质、细胞核蛋白，Bradford 法检测蛋白质的含量，-70℃保管。

    1.2.3  Western blot测定蛋白的表达  转染p65siRNA72h后，从EC9706和Eca109细胞中取细胞质蛋白，与预染的蛋白质分子量规范一同上样。检测p65和非靶向MAPK蛋白表达，及细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，经12%SDSPAGE别离，电转到硝酸纤维膜上。5%的脱脂奶粉TBST溶液封锁2h，抗体按1∶100 孵育4℃过夜，TBST溶液洗濯10min×3次，硝酸纤维膜分别与辣根过氧化物酶标志的二抗（1∶50 000）室温孵育1h后，TBST溶液洗濯10min×3次，DAB显色。实验反复三次。

    1.2.4  凝胶电泳迁移率（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）检测NFκB与 DNA的分离活性  EC9706和Eca109细胞转染p65siRNA 72h后，搜集转染细胞和未转染细胞提取细胞核蛋白，检测转染前后p65与DNA分离活性的变化，办法如下：采用生物素3′末端标志法将NFκB探针5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′，3′TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′停止标志。将细胞核提取物（10μg）与生物素标志的探针在20μl的缓冲液（10M TrisHCl，pH 8.5，0.5 mM EDTA，5mM MgCl2，1M KCl，0.05% NP40，2.5% Glycerol，1μg/μl Poly (dI·dC) and 0.2μg/μl BSA）中充沛分离，行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用毛吸转移法转移至带正电荷的尼龙膜上，120mJ紫外交联5min。生物素标志的DNA探针与HRP标志的亲和素之间相分离，经过化学发光，显影，定影。

    1.2.5  流式细胞仪检测细胞周期  转染和未转染p65 siRNA的食管鳞癌细胞，在50ml培育瓶中培育，5Fu单独或结合应用，停止实验分组和处置，作用48h后，搜集细胞；1 000 r/min离心5min，弃去上清；用PBS洗两遍，离心后弃去，参加70%冰乙醇固定，4℃过夜；上机前，1 000 r/min离心5min，弃去乙醇，PBS洗三遍；参加1ml PBS制成细胞悬液，加RNaseA（终浓度50μg/ml），室温放置1h；调整细胞浓度为1×106，加1ml PI（100μg/ml），避光30min，上机检测细胞周期，每个样本检测10 000个细胞。

    2  结果

    2.1  siRNA转染食管鳞癌细胞EC9706的效率

    将荧光素标志的对照siRNA，在同样条件下转染到EC9706细胞中，置37℃、5%CO2孵育箱内培育48h，经过荧光显微镜察看转染效率，见图1。siRNA转染食管鳞癌细胞的效率可达90%以上。

    2.2  食管鳞癌细胞转染p65siRNA后p65蛋白的表达程度

    Western blot检测细胞中p65的蛋白表达程度，见图2。结果标明，与未转染p65 siRNA的EC9706和Eca109细胞相比，转染后的EC9706和Eca109细胞，p65蛋白的表达程度下调，而非靶向蛋白MAPK的表达无影响。

    2.3  食管鳞癌细胞转染p65siRNA后，NFκB与κB位点分离活性的改动

    EC9706和Eca109细胞转染p65siRNA72h后，搜集各组细胞提取细胞核蛋白，EMSA检测NFκB与DNA分离活性的变化。结果发现，与未转染p65 siRNA的EC9706和Eca109细胞相比，转染p65 siRNA的EC9706和Eca109细胞中，NFκB与DNA的分离活性明显降落，见图3。提示：p65 siRNA能够抑止p65的表达，下调NFκB与靶基因的分离活性。

    2.4  p65siRNA阻断NFκB信号通路下调CyclinD1的表达

    食管鳞癌细胞EC9706和Eca109在转染p65 siRNA72h后，分别提取细胞总蛋白检测细胞周期Cyclin D1蛋白的表达状况。结果标明，与未转染的细胞相比，Cyclin D1的表达在转染72h后开端降落，见图4。

    2.5  p65siRNA单独或结合5Fu对食管鳞癌EC9706和Eca109细胞周期的影响

    食管鳞癌细胞EC9706和Eca109按以下办法分组：未转染组；转染p65 siRNA72h组；单独运用5Fu组；转染p65 siRNA48h后，运用5Fu治疗24h组。各组细胞运用PI染色，以未转染组为对照，检测细胞周期变化状况。结果显现，EC9706和Eca109在转染p65 siRNA后，G0/G1期的细胞开端增加，同时S期的细胞逐步减少；当转染细胞结合运用5Fu时，G0/G1期的细胞明显增加，同时S期的细胞明显减少，见表1、2。

    3  讨论

    研讨标明，活化的NFκB信号通路存在于多种人类肿瘤中，作者以往的研讨已证明在两种食管鳞癌细胞中存在有激活的NFκB信号通路[5]。但是，激活的NFκB信号通路在食管鳞癌细胞的增殖及对化疗药的耐受性等机制中能否起作用，尚不分明。本研讨运用RNA干扰技术，特异性的阻断NFκB亚单位p65的表达，研讨NFκB信号通路在食管鳞癌的发作开展中的作用。Western blot实验中，将终浓度为50nM的p65 siRNA分别转染EC9706和Eca109细胞，持续作用72h，检测p65的蛋白表达程度，结果发现，在转染72h后，与未转染细胞相比，p65的蛋白表达程度也明显降落，而非靶向抗体MAPK的表达程度未遭到影响。表1  p65 siRNA转染前后与5Fu单独或表2  p65 siRNA转染前后与5Fu单独或结合

    活化的NFκB能够进入到核内，与下游调控基因上共同的κB序列分离，参与细胞的增殖、转化、浸润及抗凋亡。抑止NFκB信号通路的活性，最终是抑止NFκB与κB的序列分离，阻断它促进下游基因表达的功用。本研讨采用凝胶滞留实验检测NFκB与DNA的分离，结果发现，在转染72h后，NFκB与DNA的分离活性明显降落。以上实验结果标明，p65 siRNA能够高效的转染到食管鳞癌细胞中，特异性的抑止目的基因p65在mRNA和蛋白程度上的表达，招致NFκB与DNA分离才能降落，从而抑止NFκB信号通路的活化。

    Cyclin D1的高表达存在于多种肿瘤中，如Mega等[6]的研讨发现，在食管鳞癌组织中，Cyclin D1和E2F1的高表达会促进肿瘤的开展，招致病人的预后欠佳。在研讨中国南方的食管癌组织中发现，Cyclin D1的高表达存在于61%的样本中，提示Cyclin D1的表达是食管癌发作的早期事情，并在肿瘤的停顿中Cyclin D1的表达不时积聚[7]。本研讨采用Western blot法，检测转染p65siRNA，阻断NFκB信号通路后，能否可以下调NFκB下游基因Cyclin D1的表达。将终浓度为50nM的p65 siRNA分别转染EC9706和Eca109细胞，72h后搜集细胞总蛋白，结果发现，与未转染细胞相比，转染细胞中Cyclin D1的表达遭到抑止。本研讨还采用流式细胞仪检测食管鳞癌细胞在转染前后及单独或结合应用5Fu后，对细胞周期的影响。EC9706和Eca109在转染p65 siRNA后，G0/G1期的细胞开端增加，S期的细胞逐步减少；当转染细胞结合运用5Fu时，G0/G1期的细胞明显增加，同时S期的细胞明显减少。以上这些结果标明，由于Cyclin D1是细胞周期停止中一个重要的调理者，当运用p65 siRNA阻断食管鳞癌细胞中NFκB信号通路时，Cyclin D1的表达下调，肿瘤细胞被停滞在G1期，提示Cyclin D1是受NFκB调理的一个重要的下游基因，NFκB能够经过对Cyclin D1的调控来促进食管鳞癌细胞的增殖。p65 siRNA阻断食管鳞癌细胞中NFκB信号通路并结合运用5Fu，能够明显抑止食管鳞癌细胞的增殖，使更多细胞停滞在G1期，减少细胞的团结。

    因而，激活的NFκB信号通路在食管鳞癌细胞的增殖及耐药中起着重要的作用，经过转染p65 siRNA能够特异性的阻断NFκB信号通路，抑止食管鳞癌细胞的增殖，增加细胞对化疗药的敏理性，提示NFκB信号通路能够成为食管癌基因治疗中一个强有力的作用靶点。

【参考文献】
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[2] Yu HG，Yu LL，Yang Y. Increased expression of RelA/nuclear factorkappa B protein correlates with colorectal tumorigenesis[J]. Oncology, 2003,65(1):3745.

[3] Nair A，Venkatraman M，Maliekal TT. NFκB is constitutively activated in highgrade squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinomas of the human uterine cervix[J]. Oncogene, 2003, 22(1):5058.

[4] Takahashi Y, Nishikawa M, Kobayashi N, et al. Gene silencing in primary and metastatic tumors by small interfering RNA delivery in mice: quantitative analysis using melanoma cells expressing firefly and sea pansy luciferases[J]. J Control Release, 2005, 105(3):332343.

[5] 田芳，侯卫红，薛乐勋，等.食管鳞癌细胞中NFκB与IκBα的mRNA、蛋白表达[J].中国肿瘤临床，2006，33（4）：198201.

[6] Mega S, Miyamoto M, Ebihara Y, et al. Cyclin D1, E2F1 expression levels are associated with characteristics and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Dis Esophagus, 2005, 18(2):109113.

[7] XiaoPing H, TieHua R, Peng L, et al. Cyclin D1 overexpression in esophageal cancer from southern China and its clinical significance[J]. Cancer Lett, 2006, 231(1)：94101.